| 研究課題/領域番号 |
19H02528
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
小島 桂 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (40370655)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 遺伝子組換えカイコ / クモ糸シルク / オニグモ |
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| 研究実績の概要 |
本年度は当初計画に従って、まず茨城県つくば市においてオニグモ（Araneus ventricosus)成体を屋外採取し、糸腺組織を採取してmRNA調整ののち縦糸タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写し、最適化したSMART法にしたがって、テンプレートスイッチから2nd strand cDNA合成したのち、In-Fusion法により発現ベクターへのcDNAのディレクショナルクローニングを行った。なお、逆転写プライマー及びTSOは昨年度設計した中から最適なものを使用した。cDNAクローニングから、コロニーハイブリダイゼーションによるクモ糸タンパク質遺伝子を含むクローンの選抜を繰り返し、得られたクローンの得られたクローンのうち、長鎖のものから順にナノポアシーケンサによる配列確認を行い、タンパク質遺伝子として問題無い配列の選抜を行った。配列としては、より長鎖のものもあったが、フレームシフトやキメラ配列と思われるcDNAクローンを排除して、最終的にMaSp1（2.5kbp）、MaSp2（8.6kbp）、MaSp3（4.7kbp）、Flag(4.1kbp)の4クローンを選抜した。これらについて、カイコ組換えベクターの構築を行い、カイコに遺伝子導入を行った。現在系統化を進めている。
コガネグモについても同様に採取・ｍRNA 調製を行い報告がある配列を元にSMART報によるクモ糸タンパク質遺伝子のクローニングを試みた。その結果、縦糸タンパク質と思われるクローン（1kbp）1クローンの取得に成功した。コガネグモcDNAの取得については、得られた配列の解析を元にクローニング手法のブラッシュアップを行い、より長鎖のcDNAクローニングにつなげる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
概ね計画通りに研究を遂行した。
一方、遺伝子クローニングに難航して、目的長のcDNA取得に至らなかったクローンがあった。しかしながら、解析に必要と考えている程度のクローンの取得には成功しており、実質的に問題は無いと思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通りに研究を進める。
ただし、オニグモcDNAの取得が不十分なところもあるので、他のクモ類の優先順位を下げてオニグモのcDNAクローニングと遺伝子組換えカイコの作出・解析で成果を出すことを優先する。
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