| 研究課題/領域番号 |
19H02530
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
杉浦 慎治 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (10399496)
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| 研究分担者 |
松阪 諭 筑波大学, 医学医療系, 教授 (00372665)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 血管 / 組織工学 / 生体模倣システム / 灌流培養 / マイクロ流体デバイス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ハイドロゲルを足場とした微小血管組織を形成するため、ハイドロゲルを導入するチャンバーを有するマイクロ流体デバイスを作製し、血管内皮細胞を含むハイドロゲルをチャンバーに導入し、培養液を加圧浸透して、ハイドロゲル内に微小血管組織を形成する方法を構築している。培養液を循環するために、これまでに我々が独自に開発してきた圧力駆動型の循環培養機構を用いて研究開発を進めている。昨年度までに微小血管組織の培養に適した圧力駆動型のマイクロ流体デバイスの構造について検討し、マイクロ流体デバイスを試作し、血管組織の構築方法について検討した。その結果、ハイドロゲルにヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECS）を導入して血管組織を作製する手法を確立した。今年度は、血管組織を構築する際のハイドロゲルの導入方法、細胞種の検討、培養液を灌流する際の圧力条件について検討した。ハイドロゲルに対して、培養液を加圧浸透させながら血管組織を培養することで、静置培養と比較してより大きな血管組織を構築できることが確認された。また、血管組織を構築する際に間葉系肝細胞（MSC）や線維芽細胞（FB）と共培養した効果についても検討した。さらには、形成された血管組織のバリア能や組織構造の評価方法に関する予備検討を行った。一連の結果を受けて特許を出願する準備を進めており、特許出願後、速やかに学会発表や論文発表を中心とした成果発表を進めていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、血管組織を構築する際のハイドロゲルの導入方法、細胞種の検討、培養液を灌流する際の圧力条件について検討した。ハイドロゲルの導入方法に関してはハイドロゲルチャンバーの中央部から導入する方法と両端から導入する方法について検討し、両端から導入した方が気泡の混入が少ないことを確認した。本研究の方法では、フィブリンゲルにヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECS）を包埋して血管組織を作製する手法を用いているが、この際に、際に間葉系肝細胞（MSC）や線維芽細胞（FB）と共培養した効果についても検討した。共培養の際にＭＳＣはＨＵＶＥＣと同様にフィル部リンゲルに包埋した。一方、ＦＢは増殖が速いためフィブリンゲルに包埋するとその増殖により血管組織の導通に支障をきたすため、培養液を循環する際に培養液を貯留するチャンバーにセルカルチャーインサートを配置してその中で培養した。ＭＳＣやＦＢが存在すると血管組織の成熟が促進される様子が観察された。特にＭＳＣが共存する場合は、長期間にわたって血管組織構造が維持された。さらに、ＭＳＣが共存する場合は血管壁のデキストランのバリア能が向上する様子が観察された。また、導通した血管組織には傾向微粒子を灌流することが可能であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度はこれまでに構築した血管組織の形成方法について、各種定量的評価を行っていく。まず、血管組織を構築するマイクロ流体デバイスの流量について定量評価を行う。マイクロ流体デバイスはハイドロゲル内を透過する往路の流路と返送用の流路があり、これらの流量を評価する。また、ＭＳＣの共培養効果についても定量評価を行う。ＭＳＣを含む場合と含まない場合において、形成される血管組織内を流れる培養液の流量の継時変化を測定する。また、蛍光デキストランを導入し、血管の形態について評価する。具体的には２D面積、太さ、方向、分岐数、分岐長さ、総合長さの変化などを定量的に評価する。また、培養液の灌流方法について、静置、往復(2 kPa)、循環（圧力0.5, 1.0, 2.0 kPa）の各種条件においても、形成される血管組織内を流れる培養液の流量の継時変化と、蛍光デキストランを導入した際の血管の形態を評価する。また、蛍光デキストランの血管壁の透過速度を定量評価することによって、形成された血管のバリア能について評価する。デキストランの透過係数を文献値と比較することで、形成された血管のバリア能の性能を評価する。また、形成された血管組織の構造と機能を組織免疫染色により解析する。具体的には、血管内皮細胞のマーカーであるCD31とＭＳＣのマーカーであるalpha-SMAにて染色し、細胞の局在について確認する。さらには、血管内皮細胞のタイトジャンクション形成にかかわるマーカーであるVE-cadherin、ZO-1、血管マトリックスのマーカーであるlamininなどで染色し、形成された血管組織の機能を評価する。特に MSCとの共培養の有無で血管組織の機能がどう変化するか検討する。
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