| 研究課題/領域番号 |
19H02567
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
川井 隆之 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (60738962)
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| 研究分担者 |
谷口 雄一 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, ユニットリーダー (90556276)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | キャピラリー電気泳動 / 一分子観察 / 糖鎖 / タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の最終目的は，ナノスケール電気泳動において一分子感度の糖鎖分析を実現することである。この前段階として，まずマイクロ空間を利用したキャピラリー電気泳動 (CE) と一分子蛍光顕微鏡観察を組み合わせた一分子CE分析システムを構築し，電気泳動と一分子観察を両立するための分析条件の検討を行った。通常，マイクロ空間では分子拡散によって一分子が激しく動くため，高速カメラを用いても一分子毎にその動きを追跡することは困難である。そこでまず，糖鎖より高分子量で拡散が遅いタンパク質をcyanine5 (cy5) で蛍光標識して分析を行った。ウシ血清アルブミン (BSA) をモデル試料として一分子CE分析を行った結果，1フレームあたり50 ms以下程度のスキャンスピードであれば，電気泳動で高速で移動するcy5-BSA分子を明瞭に可視化して動画として取得できることが分かった。得られた一分子CE分析動画から，検出されたBSA分子を一分子ずつ追跡し，時間に対する分子数のヒストグラムとしてプロットしたところ，一般的なCE-蛍光検出分析で得られるエレクトロフェログラムと同様に，ピーク状のプロファイルが得られた。このことから，最適化された実験条件では，一分子感度で電気泳動分析を実施できことが示された。続いてovalbuminやlysozymeを同様に分析したところ，BSAとは異なる検出時間にピークトップを持つヒストグラムが得られ，通常のCE-蛍光検出分析同様にタンパク質分離と一分子検出を両立できるポテンシャルを確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
世界で初めてとなる一分子電気泳動分析に成功し，本研究コンセプトを実証することに成功した。2020年度から順次糖鎖や糖タンパク質の解析を実施することで，最終年度である2022年度までに十分一分子糖鎖分析を実現できるものと期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究開始年度である2019年度に既に一分子分析コンセプトを実証できたが，繊細な一分子観察環境と再現性に乏しい電気泳動分離により，安定的にデータを取得できるまでには至っていない。2020年度は，試料を再現よく分離し，安定的に一分子ずつカウントできる頑健な一分子分析システムを構築することを目指す。これまではキャピラリーをフッ酸で処理して局所的に壁厚の薄い部位を加工することで，石英ガラスによる光の屈折が一分子観察へ及ぼす影響を最小化していた。しかしこの構造は脆く頻繁な破損や再現性の低さの主要因となっていた。そこでキャピラリーを加工せず，その末端部分に一分子観察用の専用チャンバーを設けることで，キャピラリー電気泳動と一分子観察条件を独立的に制御し，安定的な分析を実施できるシステムを構築する。これにより複数のタンパク質や糖鎖を再現よく分離し，分子カウントできるシステムを完成させ，一細胞レベルの微量生体試料から実際にこれらの生体成分を一分子感度で分析可能であることを実証する予定である。
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