| 研究課題/領域番号 |
19H02664
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
八木 一三 北海道大学, 地球環境科学研究院, 教授 (40292776)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脂質二重膜 / 自己組織化膜 / 膜蛋白質 / 一酸化窒素還元酵素 / 表面増強赤外分光法 / 振動和周波発生分光法 / テラヘルツラマン散乱分光法 / 蛋白質電気化学 |
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| 研究実績の概要 |
表面増強赤外吸収（ＳＥＩＲＡ）分光法を用いて、電極表面に膜蛋白質である一酸化窒素還元酵素（ＮＯＲ）を固定する際、リンカーとなる自己組織化膜（ＳＡＭ）のアルキル鎖長と末端官能基の比率を変化させ、ＮＯＲの配向制御が可能であることを見出し、さらにＮＯＲ周辺に形成する脂質二重膜（ＢＬＭ）の密度も変化することを明らかにした。そしてＮＯＲの吸着量が多く、その配向性が制御されている一方、ＢＬＭが疎にパックされた界面において、一酸化窒素（ＮＯ）還元反応の中間状態と考えられるヘムｂ3サイトに吸着したＮＯバンドを観測することができた。一方で、非ヘムＦｅＢサイトに対する配位構造が異なる変異体をもちいた実験では、ヘムｂ3サイトに吸着したＮＯが観測されなかったことから、ヘムｂ3サイトへのＮＯ吸着には、非ヘムＦｅＢの関与が必要であることもわかった。つまり、現状中間体である吸着ＮＯは、ヘムｂ3サイトに強く吸着する一方、非ヘムＦｅＢサイトにも緩く吸着した橋かけ構造をとる可能性が高いと考えられる。現在、15ＮＯを用いた実験により反応機構の確定を目指している。
また、酸素還元酵素としてシトクロムｃ酸化酵素（ＣｃＯ）の電極表面への固定と各種振動分光法による界面構造計測についても検討を開始した。ＣｃＯは分子サイズが大きいため、ＳＥＩＲＡでは今のところ、αヘリックスの振動スペクトルは計測できているものの、明確な活性サイトへの分子吸着が計測できていない。可視光の共鳴を利用可能なＶＳＦＧあるいはテラヘルツラマン散乱での計測を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の当初の目的であった一酸化窒素還元酵素（ＮＯＲ）における一酸化窒素（ＮＯ）吸着状態の同定にある程度成功した。現時点では、ヘムＢ３サイトへのＮＯ吸着とそのＮＯへの非ヘムＦｅＢサイトの関与が明確であるため、この2つのサイトに橋かけ吸着したＮＯが中間体として考えられるが、Ｎ２Ｏ発生によるＮＮ結合が観測されていないため、明確な同定には至っていない。今後、15ＮＯを用いた実験により新しい結果が得られれば、分光電気化学を用いた新しい酵素機能へのアプローチが実現できると考えている。
一方、3つの分光法の一つである振動和周波発生（ＶＳＦＧ）分光法については、光源となるフェムト秒レーザーに原因不明の停止が頻繁に起こり、この1年間はほとんど利用できなかった。最近ようやく原因が循環冷却水にあることがわかり、対策を施すことで、従来通りの運転が可能になった。今後の研究には問題なく利用できることが確認できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は上述したとおり、一酸化窒素還元酵素（ＮＯＲ）については同位体を用いた分光電気化学により、反応機構の確定に至る実験的証拠の収集に取り組む。
また、酸素還元酵素としてシトクロムｃ酸化酵素（ＣｃＯ）の電極表面への固定と各種振動分光法による界面構造計測についても検討を開始した。ＣｃＯは分子サイズが大きいため、ＳＥＩＲＡでは今のところ、酵素の電極表面への固定によるαヘリックスの吸収バンド（アミドＩとＩＩ）の増大は計測できており、比較的配向していることが予想される。一方で、ヘム鉄に強く吸着するプローブ分子を用いても明確な活性サイトへの分子吸着が計測できていない。これは、ＳＥＩＲＡ活性な領域から活性サイトが外れているか、あるいは活性サイトに吸着した分子が電極表面と平行に配向している場合であり、いずれが影響しているか分からない。今後は、可視光の共鳴による信号増大を利用可能なＶＳＦＧあるいはテラヘルツラマン散乱での計測を検討している。
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