| 研究課題/領域番号 |
19H02745
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | バイオイメージング / 生物発光 / RNA |
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| 研究実績の概要 |
本研究は生きたままの培養細胞試料を対象に、細胞サイズより高い解像度で特定の遺伝子発現の時空間プロファイルを可視化追跡する手法の開発を目指している。この目的のために、20１９年度までにRNA定量発光プローブの設計と開発を行った。2020年度には生きた培養細胞内における本プローブの性能評価を行った。
本プローブは変異RNA結合タンパク質ドメインmPUMと発光タンパク質NLucの二分割体からなる。標的RNA存在下において、本プローブのmPUM領域が標的RNAに結合することで、NLuc二分割断片が互いに近接し再構成反応が生じ発光を示す。二分割蛍光タンパク質再構成反応と異なりNLucの再構成反応は可逆的であることから、本プローブはRNA量の増減に応答した発光の増減が期待できる。
標的RNAとしてマウス由来β-actin mRNAを選び、 作成したプローブの遺伝子をヒト由来細胞株HEK293およびマウス由来細胞株NIH3T3に導入した。これら細胞の発光測定を行ったところ、マウス由来細胞であるNIH3T3のみで発光が検出され、標的遺伝子を持たないヒト由来細胞であるHEK293細胞では有意な発光が検出できなかった。また、HEK293細胞にプローブの標的配列と赤色発光タンパク質mCherryの融合遺伝子をプローブ遺伝子とともに導入し発光顕微鏡を用いて１細胞解像度で観察した。その結果、個々の細胞におけるプローブ由来の発光強度とmCherry由来の蛍光強度に相関が見られた。この結果から、生細胞内において本プローブは標的遺伝子の存在量に応じた発光強度を示し、顕微鏡により１細胞解像度で標的遺伝子発現量を評価できることが確かめられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究での研究開発計画は、第一にRNAプローブの設計と作成、第二に作成したプローブの試験管内および生細胞内での性能評価、第三に細胞生理現象進行過程における生細胞内遺伝子発現量及び細胞内局在変化の可視化検出の実現からなる。2019年度・2020年度に行った研究において、上記研究開発計画の第一・第二段階までは達成できており、これは当初計画通りに研究が進展していると言える。
それに加えて、2020年度にはmCherryによる遺伝子発現量レポーターを開発し、本プローブが検出する遺伝子発現量とmCherryが示す遺伝子発現量との相関を解析した。その結果からも、プローブ発現量のばらつき由来による避けられない発光値のゆらぎはあるものの、シングルセル単位での遺伝子発現量の定量化について評価できた。また、マウス由来細胞とヒト由来細胞での発光地の測定・解析の結果から、本プローブが示すバックグラウンドは非常に低く抑えられており、生細胞における遺伝子発現量の定量に優れた性能を有することが示された。
これらの結果から、本研究の進捗状況は当初の計画以上に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方策として、2019年度、2020年度に開発したRNAプローブを、実際の細胞生理機能の過程における遺伝子発現可視化解析に適用する。具体的には線維芽細胞の刺激入力に応答した遊走反応における遺伝子発現量の変化および細胞内局在の可視化、および神経細胞における軸索内RNA局在や軸索伸長反応時のRNA局在の変化について可視化解析を試みる。
線維芽細胞は外部から成長因子刺激を受けることで細胞膜のラッフリングや遊走を示す。その際、ラッフリング部分や遊走する先頭領域にはβアクチンmRNAが集合することが知られている。一方で、そのRNA集合は多くの場合固定細胞における染色像で観察されたもので、生細胞における数時間に渡るRNA局在変化は観察されていなかった。本研究では開発したプローブを用いて生きた線維芽細胞におけるRNA量と局在の変化の可視化観察を試みる。また神経細胞においては軸索伸長に応じてRNA特定のRNAが軸索を輸送されることが知られている。このRNA局在について本プローブを用いて可視化解析することを試みる。
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