| 研究課題/領域番号 |
19H02826
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
神谷 真子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (90596462)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 蛍光プローブ / がん検出 / 光機能性分子 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らはこれまでに、標的酵素と反応して初めて蛍光性と細胞内滞留性を同時に獲得し、標的酵素活性をシングルセルレベルで検出することが可能な蛍光プローブの開発に成功した。本年度は、上記の分子設計に基づき、がん細胞に特徴的な酵素活性を検出するプローブ群を開発するべく、標的酵素の拡充ならびに光増感剤への構造展開を行った。
まず標的酵素を拡充するべく、外科手術臨床検体を用いたこれまでの検討から一部のがんで活性が亢進していることが確認された、gamma-glutamyltranspeptidase (GGT)を選定し、GGTを標的とした新たな蛍光プローブ4-CH2F-HMDiEtR-gGluの合成と評価を行った。その結果、本プローブはGGTとの反応によりアザキノンメチド活性中間体を産生し、それが細胞内求核分子と反応して蛍光性付加物を産生することが明らかとなった。さらに、GGTを高発現・低発現する培養がん細胞に適用したところ、GGT発現量に応じた蛍光シグナルを示し、さらにその蛍光シグナルは洗浄・固定後に耐性があり、既存プローブに比べて細胞内滞留性が向上したことが示された。一方で、本プローブではGGTを発現するがん細胞をシングルセルレベルで検出することが難しいことも明らかとなり、今後の分子設計の指針となる重要な知見を得た。
さらに、以前開発したbeta-galactosidase発現細胞をシングルセルレベルで検出可能な蛍光プローブの構造展開を行い、新たな光増感剤の開発を行った。具体的には10位元素を酸素からゼレンに置換した誘導体を開発し、in vitro、培養細胞、ショウジョウバエ個体を用いた評価を行い、beta-galactosidaseを発現する細胞選択的に細胞死を誘導できることを示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
分子内スピロ環化平衡に基づく蛍光制御とアザキノンメチド化学に基づく細胞内滞留性の制御を組み合わせることで、GGTを標的とした新たな細胞内滞留型蛍光プローブを開発した。本プローブにより得られる蛍光シグナルは、洗浄や固定操作に対して耐性があるため、長時間に渡る観察や免疫組織学染色との併用が可能になると期待される。さらに、アザキノンメチド活性中間体とキノンメチド活性中間体の反応性の違いも明らかとなり、GGT発現がん細胞をシングルセルレベルで検出する蛍光プローブを設計・開発するにあたり重要な知見が得られ、今後に繋がる結果となった。
また今回開発したactivatable光増感剤は、酵素を標的とした従来までの光増感剤ではなしえなかった細胞内滞留性を有し、beta-galactosidase発現細胞をシングルセルレベルで死滅させることが可能であることが明らかとなった。また、生きた組織中や動物個体におけるbeta-galactosidase発現細胞でのみ、細胞死を誘導することが可能であるという画期的な成果も得られた。今後、がんで亢進している酵素を標的とした分子に展開することで、がん細胞をシングルセルレベルの分解能で死滅させることができる新たな光線力学療法の確立に繋がると考えている。本成果は、その分子設計の独創性や生物学・医学への応用可能性が評価され、ACS Central Scienceに採択・掲載された。
これらの成果は当初目標としていた計画以上の成果であったため、上記の評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに開発した4-CH2F-HMDiEtR-gGluを担がんモデルマウス（腹膜播種モデルマウス・皮下移植マウス）に適用し、GGTを発現するがん組織の蛍光検出が可能か評価する。同時に、既存プローブと比較して長時間に渡るin vivoイメージングが可能か、また得られる蛍光シグナルに固定処理耐性があるか、免疫組織学染色との併用が可能かを評価する。さらに、これまでの検討から、4-CH2F-HMDiEtR-gGluを用いた場合にはGGT発現がん細胞をシングルセルレベルで検出することは難しいことが明らかとなったため、分子設計の見直しを行い、GGTを発現するがん細胞をシングルセルレベルで検出することが可能な新たな蛍光プローブの開発を試みる。具体的には、GGTとの反応によりキノンメチド活性中間体が産生するよう分子を設計・開発する。この際、自己分解性リンカーを介してGGT基質部位を導入する設計も検討する。さらに、in vitroでの酵素反応、求核性種との反応性を評価するとともに、GGT高発現がん細胞、低発現がん細胞を用いた性能評価も順次進め、GGT発現がん細胞のみをシングルセルレベルで検出可能か評価していく。その他、異なる波長域で機能する蛍光骨格の選定や標的酵素の拡充についても検討を開始し、がん細胞が有する特徴的な“酵素活性パターン”を可視化する多色・多機能な有機小分子蛍光プローブ群を開発していく。
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