| 研究課題/領域番号 |
19H02833
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
藤田 大士 京都大学, 高等研究院, 准教授 (20713564)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | タンパク質 / パラジウム / 自己集合 |
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| 研究実績の概要 |
2019年度は実際、予備検討でも用いていたPdnL2n型錯体ケージを用いて、空間的に拘束されたタンパク質の基礎的な振る舞いを調査した。その結果、空間拘束された酵素は、「nativeの状態と同様に振る舞い同等の酵素活性を保持している」「native酵素が凝集沈殿する条件でも凝集沈殿を起こさない」「室温で長期安定保存可能」「拘束空間中にて部分的変性を起こした場合でも、リフォールディング挙動が観測される」といった期待通りの特性を有していることが明らかになった。しかし同時に、初年度に行った各種試験の結果、現状のタンパク質包接ケージ分子は、いくつかの制限を有していることがわかった。これらは将来的に包接対象のタンパク質を拡大していく際に、ひとつの足かせになることが予想される。そこで2020年度は、ケージ分子のバリエーションを2-3種類まで増やす。幸いにも近年の超分子化学分野の発展により、骨格構造を構築する手法は数多く報告されている。研究計画調書記載の通り、目的サイズのケージ分子を作る手法は確立に近づいており、設計指針は立っている。ケージの設計指針としては、大きく3つの異なるアプローチがある。より具体的には、① 安定性が高くタンパク質機能との干渉しにくい金属イオン種を用いる。② 金属イオンを用いたケージの自己集合の後に、共有結合を用いたクリッピングを行う。③ 共有結合を用いた自己集合制御により共有結合を形成する。の3点である。2020年度はこれら開発に注力、よい特性を持ったケージ分子が合成でき次第、次のステップに移行予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画調書に記載した2019年度の研究計画は、「現状保有するパラジウム錯体ケージの系を用い基礎的な知見を収集する。」であった。2019年度は実際、予備検討でも用いていたPdnL2n型錯体ケージを用いて、空間的に拘束されたタンパク質の基礎的な振る舞いを調査した。その結果、空間拘束された酵素は、「nativeの状態と同様に振る舞い同等の酵素活性を保持している」「native酵素が凝集沈殿する条件でも凝集沈殿を起こさない」「室温で長期安定保存可能」「拘束空間中にて部分的変性を起こした場合でも、リフォールディング挙動が観測される」といった期待通りの特性を有していることが明らかになった。しかし同時に、初年度に行った各種試験の結果、現状のタンパク質包接ケージ分子は、いくつかの制限を有していることがわかった。これまでに明らかになってきた制限は主に次の三点である。1) タンパク質の包接条件において、100%水系の条件が達成できず、若干の有機溶剤（ジメチルスルホキシド）の添加が避けられない。2) 骨格形成に用いているピリジン-パラジウムの配位結合の化学的特性により、使用可能なバッファーに制限がかかる。 3) 長時間の実験において、ケージの留め金として用いている金属イオン（＝パラジウムイオン）の遊離が避けられず、タンパク質によってはこれにより活性を失う可能性がある。これら短所も含めた特性を把握することは研究計画に織り込み済みであり、2020年度にはタンパク質包接に適した新しいケージ（特にパラジウムフリー）を合成し、設定目標の実現を目指す計画である。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述の通り、初年度に行った各種試験の結果、現状のタンパク質包接ケージ分子は、いくつかの制限を有していることがわかった。すべての問題に共通する問題は、分子骨格構造の留め金として働いているパラジウムイオンが生理条件と相性が悪いことに起因する。そこで2020年度は、ケージ分子のバリエーションを2-3種類まで増やす。幸いにも近年の超分子化学分野の発展により、骨格構造を構築する手法は数多く報告されている。研究計画調書記載の通り、目的サイズのケージ分子を作る手法は確立に近づいており、設計指針は立っている。ケージの設計指針としては、大きく3つの異なるアプローチがある。より具体的には、① 安定性が高くタンパク質機能との干渉しにくい金属イオン種を用いる。② 金属イオンを用いたケージの自己集合の後に、共有結合を用いたクリッピングを行う。③ 共有結合を用いた自己集合制御により共有結合を形成する。の3点である。これら3つの手法のメリットとデメリット、それから系の確立までのリードタイム（もちろんデータは存在しない。文献調査によるInitial Screening、その後研究室内で短期的な試行実験を行った上で、その難易度を見積もる。）を総合的に勘案し、注力する系を絞り込む。なお現状の優先度は、③>①>②の順である。ワンステップで共有結合ケージ分子が生成することは、将来的な系の展開の際に有利となるため、2020年度はこれら開発に注力、よい特性を持ったケージ分子が合成でき次第、次のステップに移行予定である。
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