| 研究課題/領域番号 |
19H02842
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| 研究機関 | 神奈川大学 |
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研究代表者 |
岡田 正弘 神奈川大学, 工学部, 教授 (40377792)
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| 研究分担者 |
澄本 慎平 神奈川大学, 工学部, 助教 (20852502)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 翻訳後修飾 / トリプトファン / クオラムセンシング / プレニル化 / 生物活性物質 |
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| 研究実績の概要 |
まずは、昨年度に続いて今年度も、データーベースを最新のものに更新してトリプトファンプレニル化酵素を探索したところ、新たにいくつかの候補タンパク質が検出された。そこで、それらの候補タンパク質をコードする人工DNAを購入した。続いて、購入した人工DNAを用いて候補タンパク質の過剰発現株を作成し、常法に従って候補タンパク質を発現させた。一方で、前回発現させたシアノバクテリア由来の候補タンパク質は溶解性が高く、扱いやすいタンパク質であることが判明した。シアノバクテリア由来のプレニル二リン酸合成酵素型のトリプトファンプレニル化酵素は、これまでに報告例はないため (我々が発見したKgpFは全く別の型の酵素であるため除く)、今後はこの候補タンパク質のin vitro プレニル化反応を優先的に行う予定である。
また、放線菌由来の候補タンパク質を用いたin vitro プレニル化反応に成功したものの、再現性が低く、基質として用いてきたトリプトファン単体の誘導体は、収率や検出感度の点で問題があることから、中央にトリプトファン残基を有するトリペプチド誘導体を基質として用いることを検討した。なお、我々が以前に発見した納豆菌由来のトリプトファンプレニル化酵素を用いた場合では、目的の修飾ペプチドを効率よくプレニル化できることは確認済みである。
なお、トリペプチドを用いた場合はこれまではLC-MS分析を行っていたが、収率の向上に伴い、感度は低いものの簡便な、UV吸収の極値に着目したHPLCによる分析も可能となるため、そちらについても検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
放線菌由来の候補タンパク質を用いたin vitro プレニル化反応に成功していたものの再現性が低く、放線菌由来の新規プレニル化酵素を初めて発見したと完全に証明するには至っていないため、やや遅れていると判断した。また、シアノバクテリア由来の候補タンパク質は溶解性が高く、扱いやすいタンパク質であることが判明したものの、こちらについても、シアノバクテリア由来の新規プレニル化酵素を初めて発見したと完全に証明するには至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は研究計画の後半に当たる部分を重点的に行う予定であるが、まずは、昨年度と同様に以下の研究を実施する。データーベースを最新のものに更新してトリプトファンプレニル化酵素を探索する。次に、新たに更新された候補タンパク質のうちでこれまでに検出されていない種があるようであれば、その候補タンパク質を過剰発現させる。なお、候補タンパク質をコードする人工遺伝子を用いることとする。続いて、得られた候補タンパク質を酵素として、ファルネシル二リン酸をプレニル化剤として用いた in vitro プレニル化反応を行い、目的の修飾ペプチドを生合成する。これまでトリプトファンの誘導体を基質として用いてきたが、収率や検出感度の点で問題があることから、中央にトリプトファン残基を有するトリペプチドを基質として用いることを検討する。なお、既知のトリプトファンプレニル化酵素を用いた場合では、トリペプチドを基質として用いた方がトリプトファンの誘導体を用いた場合よりも、反応は速やかに、かつ高収率で進行することは確認済みである。既にいくつかの候補タンパク質を得ていることから、同じ基質に対する反応効率の違いについても考察したい。また、これまではファルネシル基相当のフラグメントイオンを有するシグナルに着目したLC-MS分析を行っていたが、収率が向上に伴い、LC-MS分析と比較すると感度は低いものの簡便な、UV吸収の極値に着目したHPLCによる分析も可能となるため、そちらについても検討する予定である。なお、得られた修飾ペプチドを精製して構造解析を行うことは困難であるため、想定される修飾構造を有する修飾トリペプチドを化学合成により別途用意する必要が生じるが、固相ペプチド合成法と同様に、沈殿精製のみでペプチドを順次縮合可能なアンカー分子を用いた液相合成法による修飾トリペプチドの化学合成を行う予定である。
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