| 研究課題/領域番号 |
19H02848
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
佐藤 伸一 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (20633134)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | チロシン残基 / ヒスチジン残基 / タンパク質ラベル化 / 標的同定 / 熱変性 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質の変性を検出する手法や、変性度を定量する手法を開発することを目指した。タンパク質の熱変性を検出手法は、生物活性物質の標的タンパク質同定に貢献し、その作用メカニズムを明らかにする目的で有用な手法となる。
非変性時においては、一般的にタンパク質構造中の疎水性構造はタンパク質内部構造に埋もれているが、熱変性過程において、タンパク質の表面に露出することが知られている。我々はタンパク質の疎水性アミノ酸残基の一つであるチロシン残基に着目し、これまで研究を行ってきた。我々の開発したチロシン残基特異的ラベル化反応はタンパク質表面に露出したチロシン残基上で選択的に起きるため、タンパク質の熱変性度を高精度に可視化できる手法になると考えた。従来のチロシン残基修飾剤は試薬を添加した瞬間に反応が完結するものの、水中で求電子性の分解物が生じるため、チロシン残基以外のアミノ酸残基を修飾してしまう副反応が問題であった。そこで、ウラゾール骨格の化合物の誘導化とペプチドを用いた評価実験を通じて、本研究目的に適したチロシン残基修飾剤を見出すことに成功した。
また、昨年度の本研究の副次的な成果によって、タンパク質のヒスチジン残基を修飾する手法の開発に成功した。チロシン残基、ヒスチジン残基修飾法のそれぞれの反応条件を検討し、反応効率の向上、実験操作簡便性の向上に成功した。それぞれの芳香族アミノ酸残基修飾法について、被標識残基をタンパク質部位レベルで解析し、タンパク質表面への残基露出度との相関性が示唆される結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
タンパク質の熱変性過程においてタンパク質の特定残基を標識するという目的を達成するためには、変性時に露出した残基を瞬時に修飾する必要がある。試薬を添加するだけで、迅速に修飾反応が完結するチロシン残基修飾剤の開発に取り組み、成功した。従来のチロシン残基修飾剤は試薬を添加した瞬間に反応が完結するものの、水中で求電子性の分解物が生じるため、チロシン残基以外のアミノ酸残基を修飾してしまう副反応が問題であった。そこで、ウラゾール骨格の化合物の誘導化とペプチドを用いた評価実験を通じて、本研究目的に適したチロシン残基修飾剤を見出すことに成功した。本年度では、従来法との反応性の比較を行い、高いチロシン残基選択性でタンパク質を効率的に標識できることを証明した。また、細胞破砕液のような複雑なタンパク質混在系においても、本手法が適用できることを示した。
さらに、本研究により見出されたヒスチジン残基修飾法の改良に取り組んだ。ヒスチジン残基の効率的修飾法は世界的に報告例が少なく、タンパク質化学修飾研究に大きく役立つ成果となる。一重項酸素を産生する光触媒の適用範囲を拡張することができた。生体関連化学研究で蛍光分子として汎用されているBODIPYを触媒として活用できることを見出した。本成果は、これまで蛍光プローブとして用いていたBODIPY結合プローブを蛍光プローブとしてだけなく、近接標識の触媒分子としても利用できる可能性を示唆している。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度開始までに、タンパク質のチロシン残基および、ヒスチジン残基を効率的に修飾する手法を開発している。また、タンパク質の標識部位を同定しつつ、定量解析可能なプロテオミクス専用の質量分析装置を2021年度中にセットアップした。また、タンパク質の修飾部位解析の実験手法を確立した。そこで、2022年度では、本実験装置／手法を活用し、タンパク質修飾反応を最適化する。また、それを用いて、細胞破砕液などの複雑なタンパク質混合物中でタンパク質修飾反応を行い、修飾されたタンパク質のプロファイリングを行う。
特に、本年度開始までに見出したチロシン残基修飾反応は、従来の手法よりも効率的であることが示唆されている。チロシン残基はタンパク質の熱変性過程においてタンパク質表面に露出するという特徴を有しているだけでなく、リン酸化シグナル、タンパク質間相互作用の結合界面への寄与も大きいアミノ酸残基である。そこで、これらの生命現象解明のためのツールとして、本チロシン残基修飾反応を活用し、得られる成果を原著論文にまとめ上げる。
具体的な実験手法としては、独自のチロシン残基修飾法がタンパク質混合物中のどのような部位のチロシン残基を標識しているのかという事を調べるため、デスチオビオチン共役型の修飾剤で標識し、標識されたタンパク質／ペプチド断片を濃縮する。濃縮されたサンプルをプロテオミクス専用の質量分析装置で解析し、修飾タンパク質／部位をプロファイリングする。
ヒスチジン残基修飾法に関しては、より汎用性の高い手法への発展を目指した展開を進める。磁性ビーズ表面に生物活性分子を機能化したアフィニティービーズ上の空間を反応場として、生物活性分子に結合するリガンドを網羅的に解析するシステムを構築する。そのために、ヒスチジン残基修飾反応の触媒となる分子の最適化、ビーズへの機能化方法について検討する。
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