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研究代表者は大腸菌由来のRNA切断酵素MazFがRNAのACA配列を特異的に切断するが、5’側のアデノシンがメチル化されている(m6A)CA配列は切断しないことを見出していた。この性質を利用し、(m6A)CA配列を含み、5’および3’末端に、それぞれ蛍光基FAMおよびその消光基BHQ-1を付加した短いRNAオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。本年度は、このプローブを用いて、m6A脱メチル化酵素であるFTOとALKBH5の阻害剤スクリーニングを行った。すなわち、脱メチル化酵素活性が阻害された場合は、MazF処理後の蛍光強度が小さくなることを指標にした。両酵素に関して、Z‘ファクターを算出して、スクリーニングシステムの妥当性を確認した。化合物ライブラリーからスクリーニングを行った結果、FTOを強く阻害する化合物が数種得られ、共通する骨格を有する化合物が複数ヒットした。ヒットした化合物はMazFに作用はせず、また、ALKBH5の活性はほとんど阻害しないことから、FTO選択的に作用することが示唆された。また、RNA配列選択的にRNAのメチル化状態を制御する分子ツールの作製を目指して、配列選択的にRNAを認識することができるPUFタンパク質をデザインした。デザインしたPUFタンパク質と、RNAメチル化酵素複合体の必須構成因子であるMETTL14、もしくは、脱メチル化酵素FTOとの融合タンパク質を発現、精製し、in vitro条件において、この融合タンパク質が、PUF結合配列近傍のアデノシンのメチル化状態を選択的に制御できることを示した。
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