| 研究課題/領域番号 |
19H02864
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
五味 勝也 東北大学, 農学研究科, 教授 (60302197)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 薬剤耐性 / 糸状菌 / 転写因子 / ABCトランスポーター / エルゴステロール生合成酵素 |
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| 研究実績の概要 |
麹菌のABCトランスポーターAtrGのORF上流域を段階的に欠損させた株を用いてGUSレポーターアッセイにより、上流1000 bp-1300 bpに転写因子結合部位が存在することが示唆された。また、AtrAおよびAtrGのプロモーター領域を用いたゲルシフトアッセイにより、特異的なCGトリプレット配列を含む約25 bpの配列がAtrRのシスエレメントとして機能することが示された。この配列は一部のエルゴステロール生合成酵素遺伝子のプロモーター領域上にも存在し、AtrRがエルゴステロール合成酵素遺伝子の発現も制御していることが考えられた。一方、Aspergillus fumigatusにおけるクロマチン免疫沈降（ChIP）解析から、AtrRがatrGオルソログのabcG1ならびにエルゴステロール生合成酵素遺伝子cyp51Aのプロモーター領域に結合する可能性を見出した。さらに、DNaseフットプリント解析により、アゾール耐性に関わるcyp51Aのプロモーター内の34 bpの重複配列中にAtrRの結合領域が存在することが明らかになった。また、ChIP-seqによりAtrRが結合する可能性のある遺伝子が900個ほど存在することも示され、atrR高発現により標的遺伝子群の発現量の増加が認められた。
AtrRやSrbA以外の薬剤耐性に関わる転写因子を探索するため、キャンディン系（ミカファンギン）、ポリエン系（アムホテリシンB）の抗真菌薬剤を含む寒天培地に、麹菌の転写因子遺伝子の破壊株ライブラリー約600株を植菌し、超感受性または耐性を示す株をスクリーニングした。ミカファンギンでは感受性に影響が認められる株は見出せなかったが、アムホテリシンBについては耐性を示す株が3種類見出された。しかし、その耐性はMICの2～3倍程度であり、十分な耐性を示すとは言えなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゲルシフトアッセイによって麹菌のABCトランスポーターAtrAおよびAtrGのORF上流域に存在する特異的なCGトリプレット配列を含む約25 bpの配列がAtrRのシスエレメントとして機能することを示すことができた。また、Aspergillus fumigatusにおいても、ゲルシフトアッセイとChIP解析によりAtrRがatrGオルソログのabcG1ならびにエルゴステロール生合成酵素遺伝子cyp51Aのプロモーター領域に結合することが示され、さらにDNaseフットプリント解析で34 bpのプロモーター領域の重複配列に結合することも明らかとなった。この34 bpの配列と麹菌で明らかとなった25 bpの配列はきわめて高い相同性を有していることから、AtrRはABCトランスポーターとエルゴステロール生合成酵素の遺伝子で同一のシスエレメントに結合することが示されたと考えられる。以上のようにAtrRの結合するシスエレメントがほぼ同定できていることから、おおむね順調に研究が進展しているものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）AtrRとSrbAの細胞内局在解析：AtrRのN末端側とC末端側にそれぞれGFPを連結した融合タンパク質の発現株を作製し、さまざまな条件下におけるAtrRの細胞内局在を蛍光顕微鏡により観察を行う。また、AtrRとSrbA の相互関係を調べるために、atrRおよびsrbA破壊株においてそれぞれのGFP融合体を発現させ、細胞内局在への影響やプロセシングやリン酸化修飾などによる分子量変化の有無を調べる。
2）エルゴステロール生合成酵素遺伝子の発現制御におけるAtrRとSrbAの相互作用解析：AtrRとSrbAのそれぞれにmycまたはFLAGタグを付加して宿主株に導入・発現させ、共免疫沈降法により両転写因子の複合体形成の有無を検出する。また、AtrRとSrbAのそれぞれにGFPまたはVenusのN末端とC末端を連結させたコンストラクトを麹菌に導入し、両転写因子の分子間の相互作用の有無をBiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）法により検出する。
3）アリルアミン系抗真菌薬剤の感受性に関わる転写因子の探索とその機能解析：アリルアミン系抗真菌薬剤であるデルビナフィンを含む寒天培地に、麹菌の約600種類の転写因子遺伝子を網羅したライブラリーの破壊株を植菌し、超感受性または耐性を示す株をスクリーニングすることにより、この薬剤感受性に関わる転写因子を探索する。破壊株については野生型の転写因子による相補株による感受性（耐性）復帰の確認を行う。
4）麹菌アゾール自然耐性突然変異株の耐性要因の解明：自然突然変異で得られたアゾール耐性株のatrRおよびsrbAの塩基配列決定ならびに次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を行い、耐性に関与する変異責任遺伝子を特定する。
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