| 研究課題/領域番号 |
19H02867
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
政井 英司 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (20272867)
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| 研究分担者 |
菱山 正二郎 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (00353821)
桑原 敬司 長岡技術科学大学, 工学研究科, 准教授 (50525574)
城所 俊一 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (80195320)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | リグニン / 芳香族化合物 / 外膜輸送 / 内膜輸送 / Sphingobium |
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| 研究実績の概要 |
Sphingobium sp. SYK-6株におけるリグニン由来ビフェニル型化合物 (DDVA)の外膜輸送にTonB依存性レセプター (TBDR)であるDdvTが関与することを明らかにしている。外膜輸送体遺伝子の高発現が物質生産に与える影響を調べるため、有用ポリマー原料となる中間代謝物を蓄積するSYK-6株の変異株でddvTを高発現させた結果、DDVAからのポリマー原料生産速度に向上が認められた。リグニン由来化合物での培養時に誘導されるTBDR遺伝子を中心に、他のリグニン由来化合物の取り込みに関与する遺伝子を探索した結果、フェニルクマラン型化合物の代謝中間体 (DCA-C)の取り込みに関わるphcTを見出した。DCA-Cには２つの立体異性体が含まれるが、phcT破壊株による両異性体の変換の遅延に差異が見られたことから、PhcTは立体選択性を有することが示唆された。さらにSYK-6株が持つ多様なTBDRの機能解明の一環として、鉄の取り込みに関与するTBDR遺伝子群を明らかにした。
SYK-6株に存在するpcaKを除く66個のmajor facilitator superfamily (MFS)輸送体遺伝子の破壊によるvanillateおよびsyringate変換能への影響は認められなかった。さらに16個存在するMFS輸送体サブファミリーであるaromatic acid/H+ symporter (AAHS) family輸送体遺伝子の8重破壊株においても顕著な影響は観察されなかった。そこでAAHS family輸送体遺伝子が5つしか存在しないPseudomonas putida KT2440株をモデルとしてAAHS family輸送体遺伝子のリグニン由来化合物取り込みへの関与を調べたところ、3つの輸送体遺伝子が主要なリグニン由来単量体の取り込みに関与することが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の解析により、本研究の主目的の一つである外膜輸送体遺伝子高発現の物質生産速度への影響を評価することができた。また、新たにフェニルクマラン型化合物の取り込みに関与するTBDR遺伝子の同定に成功し、リグニン由来化合物の取り込みにTBDRが関与することを示す新たな例を加えるとともに、本TBDRが立体選択性を有するという興味深い知見を得た。加えてこれまでTBDRの主要な役割であることが示されている鉄の取り込みに働くTBDR遺伝子をSYK-6株において同定した。これは難分解性の芳香族化合物分解系を有する株を多数含むSphingomonad科細菌において初めての成果である。
一方、内膜輸送体遺伝子について網羅的な解析を行ってきたが、pcaK以外にリグニン由来化合物の取り込みに働く遺伝子の同定には至っていない。しかし、AAHS family輸送体遺伝子が5つしか存在しないPseudomonas putida KT2440株において、主要なリグニン由来化合物の取り込みに関与するAAHS family輸送体遺伝子を同定することに成功し、SYK-6株の目的遺伝子を同定する上で必要な多くの情報を得た。
以上、来年度以降の解析に繋がる多くの結果を得たことから、研究は概ね順調に進展していると判断された。
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| 今後の研究の推進方策 |
【リグニン由来化合物の内膜輸送体遺伝子の同定】 P. putida K2440株のリグニン由来化合物の取り込みに関与するMFS輸送体遺伝子の解析において、芳香族酸が顕著にイオン化するpH 9.0で受動拡散が抑えられることが示唆された。この知見に基づき、SYK-6株のMFS輸送体遺伝子破壊株のリグニン由来化合物変換能を高pH条件で評価し関与する遺伝子を同定する。
【リグニン由来化合物の外膜輸送に関与するTBDR遺伝子の同定】 リグニン由来化合物での培養時に発現が誘導されるTBDR遺伝子を中心に、各遺伝子破壊株の各リグニン由来化合物およびその中間代謝物の変換能を調べ、取り込みに関与するTBDR遺伝子を同定する。ビフェニル型化合物の外膜輸送に働くDdvTは、SYK-6株に存在する6つのTonBの内、TonB1と相互作用することが示唆されている。本株のtonB1破壊株は得ることができないため、tonB1を高発現させたSYK-6株で基質変換実験を行い、変換能の向上の有無を調べ、外膜輸送にTBDRが関与する基質を推定する。
【フェニルクマラン型化合物の外膜輸送に関与するTBDR遺伝子の機能解析】 phcT破壊株の細胞と細胞抽出液によるDCA-C異性体の変換能を測定し、PhcTの各異性体に対する立体選択性を明確にする。また、PhcTに存在するTonB boxおよびplug domainの変異体解析を行い、これらがPhcTの基質取り込みに必須の役割を持つかを明らかにする。
【PhcTの局在性解析とPhcTと相互作用するTonBの同定】 抗PhcT抗体を用いてPhcTの細胞内局在性を明らかにする。PhcTがSYK-6株に存在する6つのTonBの内、どのTonBと相互作用するかをクロスリンク法、ツーハイブリッド法、あるいは等温滴定型カロリメトリーによって解析する。
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