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2019 年度 実績報告書

ゲノムの再編成による多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞の創成と育種への応用

研究課題

研究課題/領域番号 19H02878
研究機関崇城大学

研究代表者

原島 俊  崇城大学, 生物生命学部, 教授 (70116086)

研究分担者 笹野 佑  崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (90640194)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード出芽酵母 / ゲノムの再編成 / ゲノム編集 / 人工ゲノム / 染色体複数部位の同時分断 / 染色体複数領域の同時部分重複 / 染色体複数領域の同時欠失 / ゲノムの多様性創出
研究実績の概要

目的の有用物質生産に最適なゲノム(本申請では”ベストゲノム”と呼ぶ)を自在に創製する育種技術の開発は微生物育種工学者の夢であると言っても過言ではない。しかし、”ベストゲノム”が具体的にどのようなゲノムで、それを合理的に設計できる知見が十分でない現在、考えられる戦略のひとつは、既存のゲノムを持つ微生物から出発して、天文学的な種類のゲノム組成を持つ細胞を誘導し、その細胞集団から、目的生産物に最適な”ベストゲノム”を持つ細胞をスクリーニングすることであろう。本研究は、この目的を実現するための技術として、出芽酵母を材料にゲノムの多様性を創り出す様々な技術の開発を目的として行っている。
ゲノムの多様性を創出する方法論はいくつか考えられる。例えば、i) 染色体を分断し(PCS法)、体細胞分裂における不均等分離による多様な組合わせの脱落を利用する方法。あるいは、ii) 染色体の部分重複技術により、多様な部分重複の組合わせを利用する方法 (PCDup法)、あるいは、iii) 染色体の部分欠失や置換の組合わせを利用する方法(PCD/PCRep法)などである。しかし、これらの方法によって多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞を効率良く創成するには、1回の形質転換で複数の部位や領域を一挙に操作できることが不可欠である。本プロジェクトの開始までに、PCS法については1回の形質転換により同時に4箇所の染色体部位の分断が可能になっていたが、その他の技術については複数領域の同時操作は可能になっていなかった。そこで初年度は、ゲノム編集技術(CRIPR/Cas9)と我々の技術を融合することによって、一度に複数領域の置換、重複ができるかどうかを検証した。その結果、前者では2領域の同時欠失/置換が、また後者では3領域の同時重複が可能となった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに、多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞の創出を目指して、染色体の分断(PCS)、部分重複(PCDup)、部分欠失(PCD)、部分置換(PCRep)などのゲノムの多様性創出技術を開発してきた。このうち、本プロジェクトの開始までに、PCS法については1回の形質転換により同時に4箇所の染色体部位の分断が可能になっていたが、その他の技術については、一度の形質転換によって複数領域の同時操作が可能になっていなかった。それが、初年度の成果により、PCDupについては同時に2箇所、PCD/PCRepについては同時に3箇所の領域の操作が可能になったことは、それなりの進展であったと考えている。この進展は、ゲノム編集技術と我々の技術との融合によって、初めて可能になったものであるが、強調しておきたいことは、本研究で開発を行っているゲノムの多様性創出技術はゲノム編集技術だけでは可能ではないことである。しかし、同時複数領域の操作については、もっと多くの領域(例えば4領域あるいは5領域)の同時操作が可能になことが必要である。そうすれば、短期間で、ゲノムの多様性の種類を大幅に増やすことができることが期待される。このことが、まだ達成できていないことは今後の課題であると考え、自己点検としては、最上位の次の区分である、「おおむね順調に進展している」とした。

今後の研究の推進方策

今後は、少なくとも以下の2つの方法論で、多種多様な人工ゲノム酵母細胞の創成とその応用を目指して行きたいと考えている。そのひとつは、i) PCS に関するもので、これまで一度の形質転換で同時に4箇所の染色体部位の分断に成功している。この成功によって、ゲノムの再編成が大きくスピードアップできることになったが、今後は、さらに少なくとも5箇所、願わくば8箇所の染色体部位の同時分断を可能する技術の確率を目指したい。
次に、ii) PCD、PCDupについては、初年度の成果によって、一度の形質転換で、それぞれ3領域、2領域の同時操作が可能になった。しかし、これでは多様なゲノム組成を持つ人工酵母細胞の効率の良い創成にはほど遠い。従って、今後は、形質転換の選択マーカーをさらに増やす、さらに多量のDNA量を使う、形質転換の方法をリチウム法から、より多くのDNAを導入できるプロトプラスト法に変更するなどを考えている。さらに、特にPCDup 法については、これまで1倍体を使っていたが二倍体を使うことを考えている。その理由は、部分重複が起こるためには、1倍体細胞体細胞を使った場合、染色体の不均等分離が必要であるが、二倍体を用いることで染色体の不均等分離が不要になり、1回の形質転換で複数領域の部分重複を起こす頻度が上昇することが期待できるからである。また、さらに良いことは、二倍体を用いることにより一倍体を用いるよりも、より多様なゲノム組成を持つ人工細胞が取得できると期待されることである。こうした方策によって、一度の形質転換によって、同時に少なくとも染色体の4領域の同時操作を可能にすることを目指したい。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] CRISPR-PCD and CRISPR-PCRep: Two novel technologies for simultaneous multiple segmental chromosomal deletion/replacement in Saccharomyces cerevisiae2020

    • 著者名/発表者名
      Easmin Farhana、Sasano Yu、Kimura Shunta、Hassan Naim、Ekino Keisuke、Taguchi Hisataka、Harashima Satoshi
    • 雑誌名

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      巻: 129 ページ: 129-139

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.08.004

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] CRISPR-PCDup: a novel approach for simultaneous segmental chromosomal duplication in Saccharomyces cerevisiae.2020

    • 著者名/発表者名
      Hassan N, Sasano Y, Kimura S, Easmin F, Ekino K, Taguchi H, Harashima S.
    • 雑誌名

      AMB Express.

      巻: 10 ページ: -

    • 査読あり
  • [雑誌論文] gRNA-transient expression system for simplified gRNA delivery in CRISPR/Cas9 genome editing2019

    • 著者名/発表者名
      Easmin Farhana、Hassan Naim、Sasano Yu、Ekino Keisuke、Taguchi Hisataka、Harashima Satoshi
    • 雑誌名

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      巻: 128 ページ: 373-378

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.02.009

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 酵母の染色体異数性が清酒醸造に与える影響と酵母育種への応用2019

    • 著者名/発表者名
      堀田夏紀、小高裕貴、野口英樹、松村憲吾、杉山峰崇、笹野 佑、原島 俊、秦 洋二
    • 学会等名
      日本生物工学会
  • [学会発表] 酵母の染色体異数性が清酒醸造に与える影響2019

    • 著者名/発表者名
      堀田夏紀、小高裕貴、野口英樹、松村憲吾、杉山峰崇、笹野 佑、原島 俊、秦 洋二、石田博樹
    • 学会等名
      日本農芸化学会
  • [学会発表] Spathaspora passalidarum 由来キシロース還元酵素を発現するSaccharomyces cerevisiae2019

    • 著者名/発表者名
      立山陽子、藤井菜穂、笹野 佑、田口久貴
    • 学会等名
      第26回日本生物工学会九州支部大会
  • [学会発表] 複数染色体領域の欠失による発酵阻害物質耐性出芽酵母菌株の育種2019

    • 著者名/発表者名
      豊留あいり、高田和真、高木佑希子、笹野 佑、田口久貴
    • 学会等名
      第26回日本生物工学会九州支部大会
  • [学会発表] 出芽酵母における任意領域の選書k受胎外環状DNA化技術の開発2019

    • 著者名/発表者名
      生田宗一郎、久冨 歩、笹野 佑、田口久貴
    • 学会等名
      第71回 日本生物工学会大会
  • [学会発表] 嫌気環境での高効率キシロース発酵に向けたSpathaspora 属酵母のキシロース代謝2019

    • 著者名/発表者名
      笹野 佑
    • 学会等名
      公益財団法人発酵研究所 第13回女性研究報告会

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公開日: 2021-01-27  

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