| 研究課題/領域番号 |
19H02879
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
野田 尚宏 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (70415727)
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| 研究分担者 |
常田 聡 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (30281645)
横田 亜紀子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20415764)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | MazEF / TAシステム / Nuclease |
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| 研究実績の概要 |
トキシン-アンチトキシンシステムMazEFは、微生物に広く保存された増殖抑制機構である。通常の生育環境下においてトキシンタンパク質MazFとアンチトキシンタンパク質MazEは複合体を形成しているが、微生物細胞がある種のストレス因子に曝されるとその結合は外れ、遊離したMazFが細胞内RNAを配列特異的に切断することで、細胞を休眠状態に追い込んだり死に至らしめたりする。本研究では、病原性微生物のMazFとMazEを取得し、それらの結合を撹乱することができる小分子化合物を蛍光スクリーニングアッセイにより探索することを目的としている。また、MazFのRNA切断活性を利用した微生物制御手法についても広く検討する。
前年度は、モデル病原性微生物のゲノム上よりMazEFを特定し、MazFタンパク質の取得とMazFが特異的に認識するRNA配列の同定に成功した。そこで、本年度においては、該当MazFの対となるMazEを取得し、MazFのRNA切断がMazEによって抑制されることを確認した。さらに、MazFの認識配列を含み、MazFによって切断されると蛍光を発するようなプローブを設計し、MazEFの結合の有無を評価するスクリーニングアッセイの基盤を確立させた。さらに、このスクリーニング手法を用いて、市販の化合物ライブラリーからMazEFの結合を撹乱する化合物の探索を進めている。一方、MazEFの結合を攪乱することに加え、MazFを他の病原性細菌に細胞外から導入し殺菌する、すなわち外来のMazFを利用した殺菌手段が考えられる。外来のMazFの病原性細菌への導入手法として、本研究ではMazF遺伝子を導入したファージを病原性細菌に感染させ、細胞内でMazFを発現させることを着想した。今年度は、M13KO7ヘルパーファージを用いてMazF遺伝子を持つファージを作製し、大腸菌に感染させる実験を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は、前年度に取得したMazFの対となるMazEを取得した。配列情報に基づいてタンパク質発現用プラスミドの構築と宿主内での発現を行い、カラムクロマトグラフィーを用いて目的とする分子量に近いタンパク質を精製することができた。取得したタンパク質とMazFを一定時間反応させた後、人工的に合成した基質RNA鎖に加えてさらに反応させ、その際のRNAの切断様式を電気泳動により評価した。その結果、取得したタンパク質の濃度依存的にMazFのRNA切断が抑制されることが確認され、これより取得したタンパク質が前年度に取得したMazFの対となるMazEであることが確信された。そこで、MazFの認識配列を含み、MazFによって切断されると蛍光を発するようなプローブを設計し、本プローブをMazFのみと反応させた際には蛍光強度が経時的に上昇し、MazEF両タンパク質と反応させた際にはそれが抑制されることを確認できた。これらの結果より、本手法がMazEFの結合の有無を確認するスクリーニングアッセイ系として機能することが示唆された。さらに、このスクリーニング手法を用いて、市販の化合物ライブラリーからMazEFの結合を撹乱する化合物の探索を進めた。現段階で数十の化合物についてスクリーニングアッセイを行ったが、MazEFの結合を有意に阻害するものは見出せなかった。一方、外来のMazFを用いた病原性細菌の殺菌技術の開発においては、遺伝子組換え技術により、まず、MazFのCDSとf1複製起点を持つファージミドを保有する大腸菌にM13KO7ファージを感染させることでMazF導入ファージを作製した。次に、MazF導入ファージを大腸菌に感染させて培養した結果、感染6時間後において、コントロール群と比較して大腸菌の増殖速度が40%程度に抑制されることが示された。以上より研究の進捗は概ね予定通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策としては、蛍光核酸プローブを用いた手法を用い、引き続き化合物ライブラリーからMazEFの結合を阻害する物質のスクリーニングアッセイを行う。また、今年度精製したMazEタンパク質は、MazFのRNA切断を抑制するために必要とする濃度が理論値より高かったため、精製の際に一部が活性を失っている可能性がある。今後は精製時の条件を検討し、より高純度のMazEFタンパク質を取得することで、タンパク質に対する化合物の濃度の最適化を行い、更に効率の良いスクリーニングを目指す予定である。これらのスクリーニング試験を幅広く行うために、複数種類のMazEFの準備を引き続き進めるとともに、蛍光プローブによるアッセイ系を構築する。それらの手法を駆使して、化合物ライブラリーからMazEFの結合を撹乱する物質を見出し、特定するための研究を計画通りに進める。一方、外来のMazFを用いた病原性細菌の殺菌技術の開発においては、モデル細菌である大腸菌に対する増殖阻害効果をさらに上げるために、由来の異なるMazFを数種類用いて比較検討する。また、殺菌対象の細菌を臨床分離株に拡大するために、より広宿主域のファージにMazFを導入する技術を検討する。
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