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2019 年度 実績報告書

担子菌の未利用生合成遺伝子を活用した有用物質生産法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 19H02891
研究機関北海道大学

研究代表者

及川 英秋  北海道大学, 理学研究院, 特任教授 (00185175)

研究分担者 南 篤志  北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40507191)
尾崎 太郎  北海道大学, 理学研究院, 助教 (40709060)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード担子菌 / 異種発現 / ゲノム編集 / 天然物 / ゲノムマイニング
研究実績の概要

担子菌由来天然物の生合成遺伝子を利用した合成法を確立するため、麹菌にセスキテルペン環化酵素(STS)遺伝子をゲノムDNAとして導入する方法を検討した。30種のSTS遺伝子のうち、約半数が正常にスプライシングされ、環化体が生成。残る半数も単純なイントロンスキップが1-2箇所/遺伝子であったため、PCR法で除去したものを再導入するとほとんど(29/30種)で、生産が確認できた。次いで当研究室の生合成研究において高収量を与えた形質転換体のゲノム解析を行い、標的とする遺伝子座を同定した。当該箇所に上記STS遺伝子をゲノム編集を利用したところ、>90%の高確率で導入され、ほぼ100%が20-50mg/Lと好収量で環化体を与えた。
こうした結果を踏まえ、神経成長因子の合成促進作用を持つ担子菌Hericium erinaceusが生産するジテルペン、エリナシン類の生合成経路の解明および酵素を用いた物質生産を上記方法の適用を検討した。当初3 種のシトクロム P450の2種で発現に問題が生じたが、 生産菌のP450 還元酵素 およびクラスター内の酸化還元酵素遺伝子を共発現することで解決した。糖転移酵素は、その活性をin vitro実験で確認できたものの、in vivoではほとんど生成しなかった。その原因を糖転移酵素の基質供給系に問題があると考え、生産菌由来の2種の酵素遺伝子を導入することで180mg/Lと高生産株の調製に成功した。
これまで担子菌自身の遺伝子操作が困難で、優れた異種発現系がなく、生合成遺伝子クラスター再構築による物質生産は困難であったが、以上の研究成果をもとに、実現可能であることを実証した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当研究室の生合成研究において高収量を与えた形質転換体のゲノム解析を行い、標的とする遺伝子座を同定し、当該箇所に選別した。これは、上記の形質転換体における外来遺伝子の導入部位が、転写活性の高い遺伝子座だと期待されるためである。実際このサイトに環化酵素遺伝子を導入したところ、約50mg/Lのテルペンの生産を確認できた。そこでCas9プラスミドのリサイクリングシステムを組合わせたゲノム編集法を用いて、アルツハイマー予防薬候補物質erinacineの生産に成功した。その収量は180mg/Lと良好であった。

今後の研究の推進方策

担子菌由来天然物の生合成酵素の中で、最も頻度高く使用されるチトクロームP450モノオキシゲナーゼがある。今回使用した子嚢菌ホストで、それが正しく機能するかや、他の遺伝子に比べイントロンが多く正くスプライシングされるかなど、確認すべき項目が多い。そこでその活性発現に重要な補助酵素について詳細な検討を行う。合わせて、昨年開発した発現の汎用性を検証する必要がある。

  • 研究成果

    (12件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 2件、 査読あり 4件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件、 招待講演 5件) 図書 (1件)

  • [国際共同研究] University of Minnesota(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      University of Minnesota
  • [国際共同研究] Northeast Forestry University(中国)

    • 国名
      中国
    • 外国機関名
      Northeast Forestry University
  • [雑誌論文] Reconstitution of Biosynthetic Machinery of Fungal Natural Products in Heterologous Hosts2020

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Oikawa
    • 雑誌名

      Biosci. Biotechnol. Biochem.

      巻: 84 ページ: 433-444

    • DOI

      10.1080/09168451.2019.1690976

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Ascomycete Aspergillus oryzae Is an Efficient Expression Host for Production of Basidiomycete Terpenes by Using Genomic DNA Sequences2019

    • 著者名/発表者名
      Shota Nagamine, Chengwei Liu, Jumpei Nishishita, Takuto Kozaki, Kaho Sogahata, Yoshiro Sato, Atsushi Minami, Taro Ozaki, Claudia Schmidt-Dannert, Jun-ichi Maruyama, Hideaki Oikawa
    • 雑誌名

      Appl. Environ. Microbiol.

      巻: 85 ページ: e00409-19

    • DOI

      10.1128/AEM.00409-19

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Efficient reconstitution of Basidiomycota diterpene erinacine gene cluster in Ascomycota host Aspergillus oryzae based on genomic DNA sequences2019

    • 著者名/発表者名
      Liu, C.; Minami, A.; Ozaki, T.; Wu, J.; Kawagishi, H.; Maruyama, J.; Oikawa, H.
    • 雑誌名

      J. Am. Chem. Soc.

      巻: 141 ページ: 15519-15523

    • DOI

      10.1021/jacs.9b08935

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Biosynthetic study of conidiation-inducing factor conidiogenone: heterologous production and cyclization mechanism of a key bifunctional diterpene synthase2019

    • 著者名/発表者名
      Tetsuya Shiina, Kazuya Nakagawa, Yukiko Fujisaki, Taro Ozaki, Chengwei Liu, Tomonobu Toyomasu, Masaru Hashimoto, Hiroyuki Koshino, Atsushi Minami, Hiroshi Kawaide, Hideaki Oikawa
    • 雑誌名

      Biosci. Biotechnol. Biochem.

      巻: 83 ページ: 192-201

    • DOI

      10.1080/09168451.2018.1536518

    • 査読あり
  • [学会発表] Biosynthetic Study and Genome Mining of Fungal Terpenoids2019

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Oikawa
    • 学会等名
      TERPNET2019
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 生合成マシナリーの再構築を用いた生物活性天然物の生合成研究2019

    • 著者名/発表者名
      及川 英秋
    • 学会等名
      2019 年度(第 34 回)日本放線菌学会大会
    • 招待講演
  • [学会発表] 生合成マシナリー再構築による生理活性物質の生産と多様性創出機構の解明2019

    • 著者名/発表者名
      及川 英秋
    • 学会等名
      日本農芸化学会東北支部 第 154 回大会
    • 招待講演
  • [学会発表] 生合成酵素を用いた生理活性天然物の生産2019

    • 著者名/発表者名
      及川 英秋
    • 学会等名
      日本農芸化学会 北海道支部第2回講演会
    • 招待講演
  • [学会発表] Efficient and versatile total biosynthesis of mushroom bioactive terpenoids2019

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Oikawa
    • 学会等名
      The Third A3 Roundtable Meeting on Chemical Probe Research Hub
    • 国際学会 / 招待講演
  • [図書] Comprehensive Natural Products Ⅲ: Chemistry and Biology,2020

    • 著者名/発表者名
      Atsushi Minami, Taro Ozaki, Chengwei Liu, Hideaki Oikawa
    • 総ページ数
      4238 (該当ページ:553-576)
    • 出版者
      Elsevier
    • ISBN
      978-0-08-102691-5

URL: 

公開日: 2021-12-27  

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