担子菌の未利用生合成遺伝子を活用した有用物質生産法の開発

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H02891
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 及川 英秋 北海道大学, 理学研究院, 特任教授 (00185175)
• 研究分担者: 南 篤志 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40507191) ; 尾崎 太郎 北海道大学, 理学研究院, 助教 (40709060)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 担子菌 / 異種発現 / ゲノム編集 / 天然物 / ゲノムマイニング

研究実績の概要

ナラタケArmillaria mellea抗腫瘍性物質melleolideの全遺伝子の導入による麹菌による効率的生産を目指して研究を行った。問題の水酸化酵素P450は、ナラタケ由来のP450還元酵素遺伝子を共発現することで機能し、トリヒドロキシ体を得た。一つの立体化学が望む立体配置ではなかったため、4種のredox酵素をスクリーニングして、そのうち2種を共発現することで、立体化学の反転に成功した。残る9遺伝子中7遺伝子を追加導入することで、反応工程は不明ながら、懸案であった二重結合の異性化のほか、5段階の反応が一挙に進行し、melleolideの水酸化体の合成に成功した。>200mg/Lと生産菌を遥かに上回る収量であった。

この好結果を受けて、ツキヨタケの毒成分であり、抗腫瘍性物質としても知られるilludinの異種発現も検討した。文献に報告された遺伝子情報を元に、候補となる必要遺伝子14種をcDNAとして4種のベクターに分割してプラスミドを作成した。2度の形質転換でこれらを一挙に導入して、illudinの生産を試みたが、残念ながら生産は不成功に終わった。原因を調べたところ、最初から4段階目にある骨格転位に問題があることがわかった。今後さらなる検討を加え、克服する予定である。

本研究で開発したゲノム編集によるHot spot-knockin法を増やすため、インドールジテルペン-ロリトレム、マイコトキシン-ブレビアナミド、酸無水物二量体ゾフィエリンなど生物活性糸状菌代謝産物の機能解析を行い、顕著な成果をあげることに成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

担子菌由来、生物活性天然物の生産に関する汎用的な方法論は、これまでになかった。前年度、Cas9プラスミドのリサイクリングシステムを組合わせたゲノム編集法であるhot spot-ノックイン法を用いて、アルツハイマー予防薬候補物質erinacineの生産を達成した。今年度は抗腫瘍性物質melleolideの生合成遺伝子（13種）を、同様にしてモデル宿主である麹菌に導入することで、本物質の高収量での生産を達成した。研究は順調に目的を達成しつつある。合わせて糸状菌代謝産物に本法を適用し、3種の天然物の生産にも成功した。

今後の研究の推進方策

一般に多数の不斉中心を持つ、セスキテルペンやジテルペンの有機合成による物質生産は、多数の工程数を要するため、時間的にも、収量的にも達成は困難である。今後は、より多くのテルペンへの適用で本法の汎用性を検証する。また単なる遺伝子導入という単純作業を行うだけでなく、複雑な骨格合成を行う際に発見される興味深い反応の機構を、重要中間体を類似の手法で入手し、詳細に解析し、今後の人工的な経路改変に役立てたい。

研究成果

• [国際共同研究] University of Michigan(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Michigan
• [国際共同研究] University of Oxford(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Oxford
• [国際共同研究] Shandong University(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Shandong University
• [雑誌論文] Heterologous production of fungal natural products: Reconstitution of biosynthetic gene clusters in model host Aspergillus oryzae (2020)
  • 著者名/発表者名: H. Oikawa
  • 雑誌名: Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 巻: 96 ページ: 420-430
  • DOI: 10.2183/pjab.96.031
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predicting the chemical space of fungal polyketides by phylogeny-based bioinformatics analysis of polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase and its modification enzymes. (2020)
  • 著者名/発表者名: A. Minami, T. Ugai, T. Ozaki, H. Oikawa
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 10 ページ: 13556
  • DOI: 10.1038/s41598-020-70177-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biosynthesis of Indole Diterpene Lolitrems: Radical-Induced Cyclization of an Epoxyalcohol Affording a Characteristic Lolitremane Skeleton (2020)
  • 著者名/発表者名: Y. Jiang, T. Ozaki, M. Harada, T. Miyasaka, H. Sato, K. Miyamoto, J. Kanazawa, C. Liu, J. Maruyama, M. Adachi, A. Nakazaki, T. Nishikawa, M. Uchiyama, A. Minami, H. Oikawa
  • 雑誌名: Angew Chem Int Ed. 巻: 59 ページ: 17996-18002
  • DOI: 10.1002/anie.202007280
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fungal-derived Brevianamide assembly by a stereoselective semi-pinacolase (2020)
  • 著者名/発表者名: Y. Ye, L. Du, X. Zhang, S. A. Newmister, M. McCauley, J. V. Alegre-Requena, W. Zhang, S. Mu, A. Minami, A. E. Fraley, M. L. Adrover-Castellano, N. A. Carney, V. V. Shende, F. Qi, H. Oikawa, H. Kato, S. Tsukamoto, R. S. Paton, R. M. Williams, D. H. Sherman, S. Li
  • 雑誌名: Nat Catal 巻: 3 ページ: 497-506
  • DOI: 10.1038/s41929-020-0454-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Oxidative Ring Contraction by a Multifunctional Dioxygenase Generates the Core Cycloocatadiene in the Biosynthesis of Fungal Dimeric Anhydride Zopfiellin (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Shiina, T. Ozaki, Y. Matsu, S. Nagamine, C. Liu, M. Hashimoto, A. Minami, H. Oikawa
  • 雑誌名: Org Lett, 2020, 22, 5, 巻: 22 ページ: 1997-2001
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.0c00340
  • 査読あり
• [雑誌論文] Total synthesis of alkaloids using both chemical and biochemical methods (2020)
  • 著者名/発表者名: R. Tanifuji, A. Minami, H. Oguri, H. Oikawa
  • 雑誌名: Nat Prod Rep 巻: 37 ページ: 1098-1121
  • DOI: 10.1039/c9np00073a
  • 査読あり
• [雑誌論文] 糸状菌由来生物活性天然物の全生合成 (2020)
  • 著者名/発表者名: 南 篤志、尾﨑太郎、及川英秋
  • 雑誌名: ファインケミカル 巻: 49 ページ: 19-24
• [学会発表] 糸状菌天然物の網羅的生産法の開発への挑戦：きのこ由来天然物も合成可能か？ (2020)
  • 著者名/発表者名: 及川英秋
  • 学会等名: 高分子学会北海道支部
  • 招待講演
• [図書] Comprehensive Natural Products Ⅲ: Chemistry and Biology (2020)
  • 著者名/発表者名: C. Liu, A. Minami, T. Ozaki, and H. Oikawa
  • 総ページ数: 4238
  • 出版者: Elsevier
  • ISBN: 0081026900