| 研究課題/領域番号 |
19H02893
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
臼井 健郎 筑波大学, 生命環境系, 教授 (60281648)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / Claudin / 環状デプシペプチド / 構造活性相関 |
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| 研究実績の概要 |
タイトジャンクション（TJ）は、皮膚や粘膜等の上皮で細胞同士を強く接着する細胞間接着構造の一つであり、体外の異物に対する主要なバリア機能を果たしている。我々はニジマスの腸内細菌が生産するMA026が、TJを緩める（開口させる）ことを明らかにし、本物質がバイオ医薬品の非侵襲的投与に有効である可能性を報告した。MA026は、TJ構成タンパク質であり、ヒトでは27種あるclaudinファミリーの１つ、claudin-1 と結合することが報告されていた。昨年までに、報告されている構造に誤りがあること、アラニンスキャン体による構造活性相関検討、及び結合部位と考えられるVFDSLL配列とその他のclaudinの相同領域ペプチドによるTJ開口活性に対する競合阻害検討を報告してきた。
本年度は、MA026生産菌の培養・ゲノム解析、及びアミノ酸のDL置換体の構造活性相関検討を行い、以下の結果が得られた。
１）生産菌培養液からのMA026大量精製スキームを確立し、MA026の他、４種類の生合成類縁体を得た。これらの類縁体のTJ開口活性を検討したところ、MA026より弱いもののTJ開口活性を示すものを見出した。
２）MA026生産菌の全ゲノム解析を行い、MA026生合成遺伝子クラスターを明らかにした。また、クラスターの配列から予想されるMA026の構造が、昨年度全合成によって明らかにしたMA026構造と一致することが明らかとなった。
３）MA026を構成する各アミノ酸のDL置換体のTJ開口活性を検討し、天然型よりも高いTJ開口活性を示す類縁体を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
生合成遺伝子クラスターから、MA026の配列が全合成で推測された配列と一致することが示された。また、生産菌培養液からの大量精製することで、化学修飾体の作成できる目途が立った。また、複数の生合成類縁体を得ることができ、いくつかはTJ開口活性を有することを見出した。これら生合成類縁体のアミノ酸配列はまだ決定出来ていないものの、TJ開口に関わる構造情報が得られると期待される。
一方、全合成でアミノ酸のDL立体が異なる類縁体を種々合成したところ、天然型MA026よりもTJ開口活性が高いものも見出すことが出来た。これらの類縁体は、claudin特異性の異なるTJ開口剤となる可能性を有しており、今後各種claudin発現細胞を用いてTJ開口活性を検討することで、ライブラリー化ができると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
MA026の大量精製系が構築できたことから、MA026の大量精製を行うとともに立体構造をX線結晶解析やNMR解析を用いて明らかにする。また、既に構造が明らかとなっているclaudin-3, 15, 19などの構造を元にclaudin-1の構造モデリングを行い、構造が明らかとなったMA026構造を用いてドッキング解析を進めることで、MA026とclaudin-1複合体モデルを作成する。作成された複合体モデルの妥当性を、変異claudin-1発現細胞を用いて検証を行う。
並行して各種claudinタンパク質を発現するMDCK II細胞を作成し、各種MA026類縁体によるTJ開口活性を検討する。得られたTJ開口活性と、結合部位と予想されているVFDSLL相同配列との相互作用を検討することで、各種claudin特異的MA026類縁体ライブラリーの作成を進める。
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