| 研究課題/領域番号 |
19H02919
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
石田 宏幸 東北大学, 農学研究科, 准教授 (60312625)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | オートファジー / 葉緑体 / Rubisco / 栄養リサイクル |
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| 研究実績の概要 |
葉緑体には窒素栄養の多くが分配されタンパク質として機能している。Rubiscoなどの主要な葉緑体タンパク質は葉の老化時や栄養飢餓条件下では分解され、転流窒素源や糖の代替呼吸基質として個体の成長や生存に重要なリソースとなる。オートファジーは様々な発生過程や飢餓などのストレス条件下で働く真核生物に普遍の細胞内分解システムである。葉緑体は特異小胞RCBとしてピースミールオートファジーにより液胞に運ばれ分解されるが、その詳細な機構は不明である。本研究では、葉緑体のピースミールオートファジーの機構について明らかにすることを目的とし、今年度は以下の解析をすすめた。
（1）オートファジー隔離膜による葉緑体包膜の選択的な認識機構の解析
先行研究で同定したレセプター候補遺伝子3種の欠損変異体の単離と、それらの変異体とgfs9-5変異体との2重変異体の作出を進め、そのうち2種類の2重変異体を獲得した。残り1種の変異体については交配後のF2の種子集団を得た。
（2）植物組織からの高純度なRCBおよびオートファゴソームの単離方法の検討
植物組織からの高純度なオートファゴソームの単離方法の確立を目指し、gfs9-5変異体から調製した細胞破砕画分を、OptiPrep の不連続密度勾配による超遠心分離に供し、葉緑体（プラスチド）の一部を内包するRCBとサイトゾルを内包する一般オートファゴソームを密度の違いに基づきそれぞれ分取した。純度に影響を及ぼすパラメータである破砕緩衝液の組成、超遠心分離の条件、免疫磁気ビーズの種類や免疫反応/洗浄液の組成などについて最適化を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
先行研究で同定したレセプター候補遺伝子3種とgfs9-5変異体との2重変異体をすべて作出し、さらにRCB形成に及ぼす影響まで解析する予定であった。しかし、2種類の2重変異体を獲得するにとどまり、また解析まで進めることはできなかった。残りの1種類の2重変異体については、交配後のF2集団のPCRによるジェノタイピングを行ったが、調べた中に2重変異体が含まれていなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
残りの2重変異体の獲得を完了するとともに、得られた2重変異体におけるRCB形成について共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析を進めていく予定である。
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