| 研究課題/領域番号 |
19H02959
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 教授 (60560779)
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| 研究分担者 |
海道 真典 摂南大学, 農学部, 准教授 (20314247)
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
岩崎 信太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80611441)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / RNAサイレンシング / RNAサイレンシングの活性化 / ウイルス複製 / RNAサイレンシングサプレッサー |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、ウイルス感染時に認められるRNAサイレンシング関連遺伝子群の発現が活性化される機構を明らかにすることである。
令和3年度には、主にAGO遺伝子の発現誘導に着目して以下の実験を行った。
AGO遺伝子の発現誘導に関与するウイルス因子に関して：ベンサミアーナタバコでアグロインフィルトレーションによってRed clover necrotic virus (RCNMV)のゲノムRNAまたは個別の遺伝子を様々な組み合わせで発現させた。どのウイルス因子がAGO遺伝子の発現誘導にどのくらい貢献するのかを定量的に評価することを試みたが、実験毎にコントロール区でのAGO発現誘導効率が大きく変動し、定量的な議論が困難な事態に直面した。原因を調べた結果、実験最初期に選抜したリファレンス遺伝子の発現が大きく変動する場合があることが明らかとなった。そこで、ベンサミアーナタバコに病原細菌を感染させた際にRT-qPCRを行なった先行研究を参考にして、新たにリファレンス遺伝子を選定し直した。選定し直したリファレンス遺伝子を用いてRT-qPCRを行なった結果、AGO遺伝子の発現上昇が10倍程度で安定した。他方、新たなリファレンス遺伝子を用いてDCL遺伝子の発現誘導を再定量した結果、有意な発現誘導が認められなくなった。
AGO遺伝子の発現誘導におけるAGOタンパク質の役割の検証：AGO遺伝子の発現誘導に、AGOタンパク質が関与するかどうかを検証するために、ベンサミアーナタバコにおいてAGO遺伝子のゲノム編集を試みた。その結果、AGO遺伝子が編集されたago変異体の作出に成功した。また、ウイルス複製時に発現誘導されるAGOタンパク質が、ウイルス複製の場に局在するかどうかを検証する目的で、ウイルスの二本鎖RNAをGFP蛍光で可視化可能なB2-GFP発現植物を導入した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
AGO遺伝子の発現を誘導するウイルス因子を探索する過程で、RT-qPCRに用いていたリファレンス遺伝子の発現が大きく変動する場合があることに気づいた。定量的な議論をすることが困難だったため、新たにより安定なリファレンス遺伝子を探索し直した。全てのRT-qPCR実験を再実施することになったため、遅れが生じている。また、コロナ禍の影響で本年度も研究室への入室人数制限が継続されたため、予定通りに研究を実施することが出来ず、進捗の遅れを取り戻せなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度の進捗状況を踏まえて、令和4年度には、以下の実験を行う計画である。なお、コロナウイルスの影響による研究室利用制限が継続された場合、遅れが見込まれる。
AGO遺伝子の発現誘導に関与するウイルス因子に関して、新たに選定したリファレンス遺伝子を用いて、RT-qPCRを再実施する。一連の実験を再実施した後、投稿論文としてまとめる。また、ウイルス複製時に発現誘導されるAGOタンパク質が、AGO遺伝子の発現誘導に必要かどうかを検証するために、ゲノム編集したago変異体を用いて、AGO遺伝子の発現誘導が起こるかどうかを検証する。ウイルス複製の場を可視化可能なB2-GFP発現植物で、AGO遺伝子の発現誘導が起こるかどうかを確認する。その後、B2-GFPの局在変化とAGO遺伝子の発現誘導の変化を経時的に観察する。さらに、B2-GFPと赤色蛍光タンパク質を融合させたAGOタンパク質を発現するコンストラクトを作出し、ゲノム編集したago変異体をバックグラウンドとして組換え体の作出を開始する。
安定的にプロトプラストを調製できるようになったため、Robosome profilingを開始する。引続き、植物細胞と大腸菌を用いた複製酵素タンパク質の大量発現を試みる。
リファレンス遺伝子の再選抜後に行なったRT-qPCRの結果、DCL遺伝子の有意な発現誘導が認められなくなったことから、当初予定していたAGO/DCL過剰発現植物の作出を取りやめ、AGO過剰発現植物の作出を行う。外来性のAGO遺伝子が過剰発現している際に、内在性のAGO遺伝子が発現誘導されると実験結果の解釈が難しくなるため、ゲノム編集したago変異体をバックグラウンドとしてAGO過剰発現体の作出を試みる。作出完了次第、ウイルス感染性実験と、ウイルスRSSの機能解析を行う予定である。
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