2019 年度実績報告書

海洋微生物由来の糖質分解酵素に特徴的なダブル吸着ドメイン構造の1分子機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	19H03094
研究機関	静岡大学
研究代表者	中村彰彦静岡大学, 農学部, 准教授 (20752968)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	キチナーゼ / 海洋性バクテリア / 吸着 / 1分子計測 / バイオマス
研究実績の概要	キチンは海洋中で最も豊富な生物由来資源であり、海洋微生物にとって重要な炭素及び窒素源である。よって海洋微生物由来のキチン加水分解酵素を調べることで高活性のキチン分解酵素を発見することができると考えられる。海洋微生物の中で主要なキチン資化性のバクテリアであるVibrio属のキチン分解酵素遺伝子を調べると陸上バクテリア由来の酵素と比較して、C末端側に追加の吸着ドメインが存在していることが明らかとなった。またこの酵素遺伝子はデータベース上で利用可能なほぼすべてのVibrio属に共通していたことから、重要な酵素であると考えられた。そこで腸炎ビブリオVibrio parahaemolyticus由来のキチナーゼ1(VpChi1)の遺伝子を合成し、それをテンプレートとして色素修飾用のフリーシステインを導入したA352C変異体及びC末端の追加吸着ドメインとリンカーを削除した変異体(A352Cありとなし)を作成した。大腸菌を宿主として発現させ精製を行った。追加ドメインを削除した酵素については結晶を作成し、2.5オングストロームの分解能で構造を決定することができた。その結果、陸上バクテリア由来酵素よりも活性中心付近のループ領域が長いことが明らかとなった。生化学的活性ではVpChi1全長の方が追加ドメインを削除した変異体よりも結晶性キチンへの親和性が高いことが明らかとなった。そこで1分子蛍光観察により吸着速度と脱着速度を計測した。その結果、２つの酵素で見かけの吸着速度は同じであるが、全長酵素の方が吸着時間が長くまた長い吸着の割合が多いことが明らかとなった。すなわちVpChi1では追加の吸着ドメインによりキチンへの吸着安定性を高めることで高い親和性を達成していることが明らかとなった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由計画通り腸炎ビブリオVibrio parahaemolyticus由来のキチナーゼ1(VpChi1)の酵素の生産、活性計測及び1分子計測を行うことができた。また1分子計測によりVpChi1の高い親和性が追加の吸着ドメインにより達成されていることも明らかにできたため、順調に進展していると考えている。
今後の研究の推進方策	追加吸着ドメインによりキチンへの吸着親和性が上昇していることが明らかになったが、追加吸着ドメインそのものの吸着特性を計測できていない。そこで吸着ドメインの蛍光標識物を作製し、計測を行う。これによりVpChi1全長のように吸着ドメインが2つ存在していることにより、相乗効果による吸着が起こるのか検証する。また今年度の計測では陸上バクテリアと同様のバッファー環境中での計測を行った。しかしVibrio属細菌は海洋中に生息するため、酵素の反応も海洋中で行われると考えられる。そこで人工海水中での活性の計測及び1分子計測を行い、塩濃度及びpHの影響を確認する。