| 研究課題/領域番号 |
19H03107
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
堀内 浩幸 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 教授 (80243608)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ゲノム編集 / ニワトリ / 性決定 |
|---|
| 研究実績の概要 |
１）Dmrt1に関して，それぞれ5’ 側開始コドン下流を標的にCRISPR/Cas9のguide RNAを複数種作製し，SSA assay並びCel-1 assayを行い，高切断活性並びに高変異導入活性を有するguide RNAを特定した。
２）培養始原生殖細胞（PGC）に対して，ゲノム編集を行い，変異導入を確認後，変異導入PGCのクローニングを行い，片方のアレルにノックアウト変異が導入された4株を取得した。
３）Dmrt1ノックアウト変異導入PGCは，ニワトリ初期胚へ移植し，生殖細胞キメラ候補ニワトリ（G0，オス）4羽を得た。
４）性成熟後，野生型のニワトリとの交配によりG1の作出と精子のゲノム解析を実施した。その結果，G1は現在まで得られなかった。また精子のゲノム解析から，移植PGC由来精子は存在するものの，Dmrt1ノックアウト変異導入精子は存在しないことがわかった。これは，PGCの精子分化において， Dmrt1が重要な役割を持つことを示唆していた。
５）すでに作出していたHEMGNノックアウト・生殖細胞キメラ候補ニワトリ（G0，オス）から，複数羽のG1の作出に成功した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定していた全ての実験計画を年度内に完了できた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
2019年度に樹立した4株のDmrt1ノックアウト（ΔDmrt1）始原生殖細胞（PGC）を移植した生殖細胞キメラニワトリ（G0）からは，G1（ΔDmrt1ニワトリ）は得られなかった。G0のオスの精子を回収し，種別判定（羽毛色遺伝子）とCel-1アッセイの結果から，移植したPGC由来の精子は存在するものの，Cel-1アッセイによるΔDmrt1-PGC由来の精子の存在は確認できなかった。すなわちこの結果は，Dmrt1は精子形成に必須の遺伝子の可能性を示唆している。この仮説を証明するためには，ΔDmrt1-PGCの生殖細胞形成過程を追跡する必要がある。そこで2020年度はG0ニワトリの数の確保とG1作出試験を継続しなかがら，ZsGreen（緑色蛍光タンパク質）発現PGC（ZsGreen-PGC）を樹立し，このZsGreen-PGCに変異導入を行い，ZsGreen-ΔDmrt1-PGCを作出し，この細胞の胚への移植実験からΔDmrt1-PGCの精子分化能を解析する。またDmrt1タンパク質検出のため，抗原性の高い領域の予測配列を合成ペプチドにし，これを抗原としてウサギポリクローナル抗体を作出したが，本抗体は，合成ペプチドは認識するものの天然型のDmrt1は認識しないことが判明した。そこで2020年度はリコンビナントDmrt1を作出し，これを免疫原に抗Dmrt1抗体を作出し，タンパク質レベルでDmrt1の半減もしくは消失を証明する。さらに，既に作出済みのΔHEMGN（Dmrt1周辺遺伝子）ニワトリの雌雄での表現型の解析を継続する。
|
