| 研究課題/領域番号 |
19H03116
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
木村 和弘 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (30192561)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | muscle / adipocyte / NGF / neurotrophin |
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| 研究実績の概要 |
動物は食餌によって得られた栄養素を代謝するが、余剰なエネルギーを感知し、白色脂肪組織（WAT）にエネルギーを中性脂肪の形で保存し、必要に応じて脂肪酸の形で全身の組織に供給する。あるいは褐色脂肪組織（BAT）において食事依存性産熱に貢献しエネルギー消費を高め恒常性の維持に働く。この二つの組織のエネルギー消費機能は交感神経系によって協調的に行われる。しかしながら脳内機構については不明な点が多い。
そこでマウスにグルコースを投与した時に起こる神経細胞の変化を調べた。脳視床下部に発現する神経の一部はグルコース濃度の変化を感知し、膜リン脂質のアラキドン酸カスケード反応によりプロスタグランディンの産生を高め末梢の糖代謝を調節すること、さらには高脂肪食投与によって上記の神経回路が阻害されることを示した。
また脳視床下部のメラニン凝集ホルモン(MCH)発現神経の特異的破壊はBATの機能を変化させることを示しMCH神経の下流でBATを支配する交感神経系が活動していると考えられた。さらに生後のハムスターで観察されるWATからBATへの転換について幾つかの候補因子同定することができた。
乳腺組織も生後に発達分化が見られるがその導管形成において転写因子Grhl-2を介して上皮細胞マーカーE-cadherinと密着結合因子Claudin4の発現を維持し導管機能を保持することが分かった。現在、妊娠、泌乳、退縮のプロセスにもGrhl2が関係するか調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1．NT4/5コンディショナルノックアウト（cKO）マウスおよびNT3コンディショナルノックアウト（cKO）マウスを作製し薬剤耐性遺伝子の除去をおこなった。繁殖を繰り返しているが食殺などもあり実験に使用可能な個体数が揃わない。
2．アディポネクチンノックアウト(KO)マウスを導入し、ホモ個体同士の繁殖が可能であった。KO、ヘテロKO、野生型で血中濃度は検出限界以下、2μg/ml、5μg/mlであった。
3．アディポネクチンKOマウスを用いてIL-8に対する走化性試験を行ったところ、KOマウスではより効率的に好中球を主として細胞の集簇が見られた。ダニ抗原に対する皮膚炎モデルでもKOマウスの方がより炎症が強かった。
4．マウス筋芽細胞の分離と培養法の確立：筋肉の研究にはC2C12細胞などの株化細胞が頻用されるが、in vivoでの状態を反映させるためマウスより筋芽細胞を分離培養した。血清10% を含む増殖培地で細胞数が増え、ウマ血清2%の分化培地で培養すると筋菅が形成される細胞が得られている。
5．NT4/5 cKOマウスおよびNT3 cKOマウスの個体数が揃わない場合に初代培養筋細胞間で比較する予定である。その際使用するCre recombinaseなどの発現ベクターの準備をおこなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究で用いる2種の遺伝子改変マウスは文部科学省新学術領域研究 学術研究支援基盤形成先端モデル動物支援プラットフォームで作成いただいた。neomycinカセットの除去の上、ダブルコンディショナルノックアウトマウス（KO）を作成中である。しかし、現在１系統の繁殖に問題を生じており、初期のマウスを用いて交配を重ね選抜をおこなっている
想定される神経栄養因子の修飾因子AのKOモデルではAの血清レベルが検出限界以下であり、野生型と大きくKOモデルでは血清レベルが検出限界以下であり、野生型と大きく異なった。そこでアディポネクチンKOマウスと結合するサイトカインの走化性について調べたところ走化性は促進され、想定される神経栄養因子の修飾因子AのKOモデルではAの血清レベルが検出限界以下であり、野生型と大きくの投与で抑制された。さらに神経成長因子の効果の増強が見られるか検討している。これらの実験結果を基にアディポネクチンの-KOマウスを使って神経栄養因子の機能を評価する予定である。
次に神経栄養因子の骨格筋での機能を評価するため、骨格筋の初代培養系を確立した。この培養系を用いて神経栄養因子やその受容体の刺激薬・阻害剤を用い前駆筋肉細胞の増殖分化にどの様な因子が関わるか確認する。同様の実験を前駆脂肪細胞においても行い、確認する。上記の遺伝子改変マウスからも初代培養筋肉細胞および脂肪細胞に加え、胎児繊維芽細胞を準備する。Creリコンビナ－ゼベクターなどの投与により神経栄養因子の発現をコントロールして因子の関与を明らかにする。このほか、yellow kkマウスを導入して肥満の進展とともに神経栄養因子がどこから分泌されるのか明らかにする。脂肪細胞と骨格筋細胞の相互作用を明らかにするため、骨格筋細胞と横隔膜細胞を培養し、脂肪細胞の培養上清の影響を調べる。脂肪細胞に筋肉細胞の培養上清を加える場合もある。
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