| 研究課題/領域番号 |
19H03118
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
中尾 亮 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (50633955)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | マダニ / 吸血性節足動物 / 共生微生物 / マイクロビオーム / パラトランスジェネシス |
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| 研究実績の概要 |
マダニや蚊などの吸血性節足動物は様々な病原体を保有し、人や動物に伝播する。一方で、節足動物は病原体以外にも様々な微生物を体内に保有し、しばしば共生微生物の力をかりて生存している。本申請課題では、３者（節足動物―病原体―共生微生物）の共生バランスの維持に重要な因子を特定し、節足動物媒介性疾病の新たな制御法の基盤を構築することを目的とする。すなわち、節足動物の生存にとって不可欠となる共生微生物由来の因子を特定し、抗節足動物ワクチンの作出へ応用する。また、節足動物体内で病原体排除にはたらく共生微生物由来の因子を特定し、その因子を人為的に組み込んだ共生菌の作出（パラトランスジェネシス）を目指す。
今年度は、国内で採集された約600個体の硬ダニおよび約100個体の軟ダニを対象に、細菌16S rRNA遺伝子（rDNA）のv3-4領域を対象としたアンプリコン解析を実施した。国内の硬ダニに優占する細菌群としてCoxiella、Spiroplasma、Rickettsia等を特定した。ザンビア、ボリビア、スーダン、マラウィ 、エジプトで採集されたマダニについても解析を実施した。特にザンビアのマダニでは、供試した23種のマダニのうち、20種でCoxiellaの保有が確認され、マダニで重要な機能を持つことが推察された。さらに、フタトゲチマダニのRNAseq解析を実施し、Coxiella共生菌のドラフトゲノムを決定した。合計10種類のビタミンB及び補因子の生合成・代謝に関わるCoxiella遺伝子が検出され、特に、パントテン酸（ビタミンB5）ならびにビオチン（ビタミンB7）の生合成に関わる一連の遺伝子群が検出された。マダニおよび蚊の細胞で分離した複数のSpiroplasma株について、無細胞培地での培養維持に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
国内の主要マダニ種について、それぞれが保有する細菌叢を明らかにした。Coxiellaなどの共生菌に加え、一部のマダニ個体からはRickettsiaやEhrlichiaなどの病原体が検出でき、病原体―共生微生物の相関解析のための基礎情報が集まった。マダニのRNAseq解析からは、共生維持に重要と思われる因子を複数特定できた。特に、ワクチン候補因子として、Coxiellaのみで完全にコードされるビタミンB生合成・代謝因子が特定できた。さらに、パラトランスジェネシスの基本技術となる、Spiroplasmaの無細胞培地での培養技術を構築できた。以上のことから、研究は当初の予定通り、おおむね順調に進んでいると自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
病原体―共生微生物の相関解析：微生物叢プロファイリングの結果から、細菌・原生生物群間の出現パターンを相関解析により導出し、正の相関、負の相関、中立の関係を定義する。病原体の出現有無と強い負の相関がみられる微生物群を、病原体排除に関与する微生物群として抽出する。さらに、実験的に病原体を感染させた節足動物個体を材料にRNA-seq解析を実施して、共生微生物由来の高発現遺伝子を特定する。
共生微生物の生存に関わる節足動物因子の特定：これまでにマダニから分離した共生微生物をマダニおよび蚊の細胞（ISE6およびC6/36）に感染させ、感染前後で発現変動のみられる節足動物遺伝子をRNA-seq解析により網羅的に検出する。今年度は、Spiroplasma属細菌とRickettsiella属細菌を用いた感染を計画する。
マダニ遺伝子をノックダウンしたマダニ個体の微生物叢プロファイリング：予備的実験として、マダニの抗酸化反応に重要なマダニ遺伝子をRNAi技術を用いてノックダウンする。ノックダウン個体を用いて、ウサギによる吸血試験に供し、吸血前後における細菌叢の経時的変化を解析する。コントロール群（PBS接種群）と比較することで、遺伝子ノックダウンが細菌叢に与える影響を解析する。本予備試験で手技が確立されたのちに、共生微生物が感染することで変動のある遺伝子のノックダウン試験とその後の微生物叢プロファイリングを計画する。
共生微生物を人為的に導入した節足動物個体の微生物叢プロファイリング：Spiroplasma属細菌およびRickettsiella属細菌をマイクロインジェクションにより、実験室内で飼育しているマダニ・蚊に対して投与する。感染前後での微生物叢を比較し、共生微生物の感染が微生物叢に与える影響を解析する。
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