研究課題
本課題は、偽遺伝子挿入あるいは塩基置換によるノンコーディングRNA(ncRNA)獲得と機能化が、既存のタンパク質をコードする遺伝子の発現スイッチを多様化しうる、という独自の発見を発展させるものである。特に、霊長類の種特異的長鎖ncRNA(lncRNA)群を介した脳遺伝子発現活性化機構に着目し、ゲノム編集脳オルガノイドのハイスループット産生系構築、トランスジェニック・イメージング・バイオインフォマティクス技術の活用を基礎に課題を進行する。本年度は、齧歯類と霊長類の神経幹細胞におけるディープシーケンシングの結果をバイオインフォマティクスにより解析し、霊長類で発現が亢進している遺伝子情報を網羅した。このうち転写因子に絞り、プロモーターノンコーディングRNA（pancRNA）が存在するものについて、その機能解析を、まず、ヒトiPS由来神経幹細胞の培養系にて行った。pancRNAをノックダウンすると当該転写因子のいずれのmRNAも発現減少したことから、pancRNAは標的遺伝子の発現を正に制御する因子であることがわかった。このことは、これまでに研究代表者がバイオインフォマティクスを駆使することで見出していた、pancRNAの遺伝子活性化機能を反映するものと考えられた。また、標的遺伝子のひとつについてオーソログ発現コンストラクトをマウス胎仔脳室内に注入し、エレクトロポレーションにより強制発現させたところ、神経幹細胞の増殖が亢進した。したがって、霊長類特異的pancRNAは機能的であり、下流遺伝子の発現調節をすることにより、神経幹細胞の数を制御できることが明らかとなった。
2: おおむね順調に進展している
今年度は神経幹細胞における霊長類特異的ncRNA情報の網羅に成功し、さらに、転写因子に絞った機能解析にも進むことができた。次年度以降はこのパイプラインを活かすことで、より精度の高い霊長類特異的機能ncRNAデータベースが拡充することが期待できる。今後は、そのデータベースから、種特異性獲得における分子メカニズムを推定していくことが重要であると考えており、そのための準備が整ってきた。
今後は、独自に作成してきたlncRNAデータベースを精細化し、種特異的lncRNAの効果の最大化につなげていく。(ⅰ) lncRNAと協働するトランス因子候補の同定ゲノム三次元構造解析を行い、トランスクリプトーム情報と合わせることで、lncRNA依存的三次元構造情報を網羅し、プロモーター-エンハンサーのペアの体系化を目指す。Hi-C法を基礎としたプロトコールにより行い、既に実績もある（平成28年度文科省新学術領域研究「先進ゲノム支援」支援採択）。エンハンサーはメガベース単位で離れていても機能的である場合もあり、RNA-seqで取得したlncRNAのうちmRNAの遠位に存在するものについて効率よくスクリーニングできる。遺伝子トランスクリプトームについては、シングルセルで行える環境を既に構築しているが、一般的にコピー数の少ないlncRNAについても高感度検出できるように改変中である。(ii) 統合解析による幹細胞動態解析：マウス脳オルガノイドの霊長類化度の最大化神経幹細胞を蛍光標識し、且つ前項目までに得た霊長類特異的機能lncRNA候補を5つまで賦与し、シングルセルRNA-seqによる細胞動態改変状況の精密なプロファイリング、細胞動態イメージングも併せ、種特異的lncRNAの組合せ効果を最適に導く予定である。以下に、改変標的となる各神経幹細胞分化ステージに対応した研究進行のタイムテーブルを示した。計画書の冒頭の概要の項に示した図に示したように、発達時期に従って、順次lncRNAの同定・機能解析を進行していく。
すべて 2020 2019 その他
すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件) 図書 (1件) 備考 (1件)
Journal of Reproduction and Development
巻: Epub ページ: Epub
10.1262/jrd.2019-164
Stem Cell Research
巻: 44 ページ: 101749
10.1016/j.scr.2020.101749
http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2019/200228_2.html
