| 研究課題/領域番号 |
19H03151
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
小倉 淳郎 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (20194524)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ゴールデンハムスター / 遺伝子ノックアウト / 疾患モデル動物 / 受精 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、多産、容易な飼育・繁殖、マウスよりも早い世代交代などを特長とするゴールデンハムスターに着目し、マウスで未解明の遺伝子のCRISPR/Cas9 KOおよびノックイン（KI）モデルの作出を試みることにある。また、得られた改変動物系統を保存するための信頼性の高い胚凍結保存法も開発する。本年度も引き続き、１）ハムスターノックアウト（KO）技術の効率化および２）ハムスター胚の凍結保存技術の開発を行なった。
１）ハムスターKO技術の効率化では、in vivo 卵管内 electroporation であるGONAD法の実験条件の適切化を行った。これまで、GONAD 後の出生率が低いことが明らかとなったので、day 1 の卵管内の卵子を検索したところ、多くの場合で未受精卵であることがわかった。昨年度は過排卵用のPMSGの注射の dose を下げることによって、妊娠率の向上に成功したが、本年はさらに、抗インヒビン血清または抗インヒビン単クローン抗体を Day 1 に注射することにより、妊娠率と出産数の向上に成功した。その結果、糖尿病候補遺伝子である Irs2ノックアウト個体を得ることに成功した。また、Mov10l1 ノックアウトの論文を投稿し、審査中である。
２）ハムスター胚の凍結保存技術の開発では、昨年度に引き続き、自然交配3日後の8-16細胞期胚を子宮灌流により採取し、凍結保存を行った。さらに本年度は新たに、卵巣移植による系統保存の試みも開始した。その結果、移植卵巣由来の産子が生まれることを確認した。今後は、凍結卵巣の移植による産子作出をめざす。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、ノックアウトゴールデンハムスターの作出とこれらの系統保存技術の確立にある。これまでに８系統のノックアウトハムスターの作出に成功した。また、Mov10l1 ノックアウトハムスターの解析が完了し、雌雄とも不妊になることを確認した。これは期待通り、マウスとは異なる表現型であり、論文投稿を行い、現在revision中である。
今年度は新たに、COVID-19のモデルとして、糖尿病を発症することが期待される Irs2遺伝子のノックアウトの作出に成功した。以上より、きわめて順調にハムスターKOの開発が進み、マウス KO では得られない遺伝子・タンパク質の機能を明らかにすることに成功した。
凍結保存技術については、胚移植法、そして胚の凍結融解後の in vitro 発生は確認したが、まだその産子への発生は確認できていない。これが今後の課題である。一方、系統凍結保存のもう一つの方法として、体外環境に敏感な胚操作を回避するために、卵巣移植の実験を開始した。幸い、ゴールデンハムスターは、もともと極めて遺伝的に均質であるので、系統間の臓器移植は問題ない。新鮮移植卵巣由来の産子を得ることに成功した。今後は、凍結移植卵巣由来の産子を得ることが今後の目標である。
以上より、おおむね順調に研究が進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
以上の通り、大きな問題は無く、順調に研究は進展しているので、これまでの研究の方向性を保ったまま、推進していく予定である。現在の最大の問題点は、最近の市販ハムスターの繁殖に関わる性質が変化（劣化）しており、過排卵処理後の性周期のずれと交配成功（in vivo 受精）の率の低下が著しいという点がある。この問題点は、同様のハムスターを用いている他施設でも生じており、大きな研究の障害になっている。現在、日本で市販のハムスター以外の系統を飼育している施設は（知る限り）皆無であるが、かつて繁殖能力が高いと言われていた系統の胚だけでなく、卵巣も凍結保存されていることがわかった。次年度は、この他施設で液体窒素中に眠っている凍結卵巣由来ハムスター系統の当施設への導入を目指し、研究の効率化を図りたい。そのためには、凍結融解卵巣の移植技術を安定化させる必要もあるため、その技術開発も進める。また、新規の KO としては、受精関連因子のKOハムスターを開発し、受精における精子－卵子膜融合のメカニズム解明の一助としたい。新型コロナウイルスの新薬開発などに用いる糖尿病が発症すると期待されるノックハムスターが生まれているので、その表現型解析を急ぐ。
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