研究課題
リボソームのストーク蛋白質は各種GTPase翻訳因子をリボソームの機能中心に運び、GTP加水分解を促進して翻訳サイクルの各段階に寄与するが、その多彩な分子機構の詳細は未解明である。本研究では、a）アミノアシルtRNAをリボソームに運搬するEF1A・GTPとストーク間の結合機構、b）EF1AのGTP加水分解後、EF1A・GDP→EF1A・GTPのヌクレオチド交換時におけるストーク・EF1A間相互作用の切り替え機構、さらに、c）新規GTPase因子YchFとストーク間の結合機構とその役割を解析し、ストークの動的で多彩なはたらきを解明する。2020年度は主に課題bに取り組んだ他、ストーク・EF1A間結合様式の可視化に取り組み、次の新知見を得た。1）古細菌におけるEF1Aのヌクレオチド交換因子EF1Bを発現調製し、その交換活性を標識GDP/GTPを用いて測定した。その結果、EF1BとアミノアシルtRNAの共存下で、有意な活性を検出した。2）EF1AとEF1B複合体を結晶化し、構造を解明した。その結果、EF1Bの結合によりEF1Aのドメイン1の位置が移動し、EF1A・GDP中のストーク結合部位となっていたスペースが完全に崩壊することが示された。EF1BによるEF1Aのストーク結合性の消失は生化学的手法でも示され、EF1Bがストーク・EF1A間相互作用の切り替えに関与することを証明した。3）高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて、リボソーム中のストークの動態を観察し、複数個のストークのそれぞれがEF1A・GTPとEF1A・GDP両者を受容し、ストークが因子を集めることを可視化により示した。以上の研究により、ストークとEF1A間の相互作用とその切り替え機構（課題aとb）が解明された。課題cについては、今年度古細菌と酵母の実験材料を調製しており2021年度の研究の準備を行った。
2: おおむね順調に進展している
本研究は、上述の課題a、b、cの解決から翻訳サイクルにおけるリボソームストーク蛋白質の動的で多彩な機能を解明することを目的としている。これまで、2019年度に課題aに取り組み、ストークが既に報告したGDP結合型EF1Aとは異なる様式でGTP結合型EF1Aに結合することを示し、ストークEF1Aの異なる2種類の構造を巧妙に認識することを国際学術雑誌に報告した。次に解明すべき疑問は、「EF1A・GDP→EF1A・GTPのヌクレオチド交換時にストーク・EF1A間相互作用の切り替えはどのようになされるのか」という点（課題b）である。2020年度にこの課題bに取り組み、EF1Aとヌクレオチド交換因子EF1Bによる複合体の結晶構造解析により、EF1BがEF1A・GDPに結合することでEF1A中のストーク結合部位の構造を崩壊し、ストークとの結合性をオフにすることを示すことができた。この結果は、ストーク・EF1AにEF1Bを作用させストークを解離させる生化学的知見と一致した。得られた構造知見は本研究の課題bに対する有力な証拠を提供するもので国際学術雑誌に報告し受理されている。当初の研究計画にはなかったが、2019年度に結晶構造解析から得られた課題aに対する結果を水溶液中の条件で確認するため、高速AFMを用いて、リボソーム中のストークとEF1Aの水溶液中の結合性を可視化することで、リボソーム粒子中の7コピーのストークにEF1A・GTPおよびEF1A・GDPの両者が結合することを示すことができた。以上のように、課題aに関して結晶構造と水溶液中の両解析で解明し、課題bに関しても有力な結晶構造データが得られ、本研究の進捗状況は概ね順調と言える。残る課題cの研究は当初予定より遅れているが、古細菌YchF、および酵母YchF（OLA1）について2021年度に向けた研究の準備は整っている。
2019年度と2020年度の研究で、上記の課題aとbに関する当初目的をほぼ達成しており、2021年度は、課題cの解明に向け、次のような実験を計画している。課題c）の研究計画c-1）古細菌YchFに関する研究：1）古細菌（Pyrococcus furiosus）由来のリボソームストーク蛋白質aP1、YchFおよび80Sリボソームを大量調製する。2）GTP/GDP存在下で、リボソームとYchF間の結合性をショ糖密度勾配遠心法により解析する。3）各種条件下でリボソームとYchFに依存するGTP加水分解活性を測定する。さらに各種変異型ストークを用いることで活性がストークのはたらきに依存することを確かめる。4）ストークaP1とYchF間の結合性をNativeゲル電気泳動、またはプルダウン法により解析する。5）ストークC末端の合成ペプチドとYchFの複合体の結晶化と構造解析を試みる。6）5の結果から、YchFとストークのC末端の結合様式を分子モデルで示し、EF1AやEF2等の他のGTPase因子とストーク間の結合様式と比較し、ストークの作用の多様性を考察する。7）YchFの構造の一部がバクテリアのRelAに類似する点を考慮して、tRNAとの相互作用等、機能面を解析する。c-2）酵母YchF（OLA1）に関する研究：1）真核細胞におけるYchFの機能面を探るため、相同組換え法によりOLA1遺伝子を酵母ゲノムより削除し、細胞の増殖への効果を探る。2）1の実験を、シクロヘキシミド等の抗生物質を添加したストレス下で実施し、遺伝子削除の効果を観察する。3）酵母細胞から得られたポリソームをショ糖密度勾配遠心で分離し、OLA1に対する抗体を用いてリボソームへのOLA1の結合性を解析する。以上の研究からYchFとストークとの相互作用、およびその役割を明らかにする。
すべて 2021 2020
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