研究課題
コヒーシンは姉妹染色分体間の接着を行う主要な構造タンパク質で、体細胞分裂における正確な染色体分配に必須である。コヒーシンはSMCサブユニットを中核とする環状構造のATPase複合体であり、リング構造を利用してDNAを束ねて接着構造を形成すると考えられている (トポロジカルなDNA結合)。本研究は、精製タンパク質を用いた試験管内再構成実験を主軸に、コヒーシンのトポロジカルなDNA結合、及びDNA複製に共役した姉妹DNA間の接着形成の分子機構を明らかにすることを目的とする。分裂酵母のコヒーシンを用いた解析から、そのDNA結合反応について主に2つの進展があった。1) 高速原子間力顕微鏡を用いることにより、DNAに結合するコヒーシンを可視化することができた。予備的ではあるが、コヒーシンは特定のドメインでDNAを相互作用している傾向が見られた。今後、より詳細にDNA結合様式を解析していく。2) コヒーシンのDNAローディングに必須の補助タンパク質であるローダーについて、それ自身がDNA結合タンパク質であること、そのDNA結合能がコヒーシンのトポロジカルなDNA結合反応を促進するために必須であること、を明らかにした。この解析から、コヒーシンはローダーと複合体を形成し、ローダーのDNA結合能を介してDNA上に集積し、トポロジカルなDNA結合反応を行うことが示唆された。また、2020年度以降の解析に必要な出芽酵母のコヒーシン及びローダーの精製系を確立した。
2: おおむね順調に進展している
コヒーシンが分子リングとしてDNAに結合するモデルは、広く受け入れられているが、その実像は不明である。現状明確な像は得られていないものの、本研究が進展することによって、コヒーシンの機能の中核であるDNA結合様式を解析できるものと期待できる。また、ローダーによるコヒーシンの促進機構について、ローダー自身のDNA結合能が重要であるという新たな知見を得ることができた。
高速原子間力顕微鏡によるコヒーシン－DNA複合体の構造を詳細に解析していく。観察ステージのコーティング法、バッファー条件等、種々の条件検討を行い、観察条件を最適化する。また、コヒーシンによる接着形成機構の解析を進める。コヒーシンはDNA複製に伴って姉妹DNA間で接着を形成する。接着形成を明らかにするために、出芽酵母の精製タンパク質を用いたDNA複製再構成系反応とコヒーシンを共役させ、接着形成を完全再構成する。2020年度は、2019年度に精製した出芽酵母のコヒーシンとローダーを用い、ローディング反応の再構成系を構築する。並行して、DNA複製の再構成系を至適化する。2019年度に精製系を構築した複製の後期課程に必要なタンパク質 (DNAリガーゼ、Fen1 ヌクレアーゼ等) を用いて、複製反応を完了させる系を構築する。
すべて 2020 2019 その他
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件) 備考 (1件)
eLife
巻: 24 ページ: e52566
10.7554/eLife.52566
https://www.nig.ac.jp/nig/ja/research/organization-top/laboratories/murayama
