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本課題では自然免疫系の一回膜貫通型のToll様受容体（TLR）を研究対象とする。TLRは様々な疾患に関与し、医学・薬学的な重要に創薬ターゲットであり、そのリガンド認識・活性化・シグナル伝達機構の正しい理解が必要とされている。これまでの研究により、TLRが特異的にリガンドを認識し、細胞外ドメインが二量体化する機構が明らかになっているが、TLR全長に関する実験データは皆無であり、細胞外から細胞内へとどのように情報が伝達されるかに関しては未解明である。本申請課題では、TLR全長の脂質二重膜上での構造および挙動を多階層で解析することを目指す。
今年度は、前年度に引き続きTLR全長の活性化状態のクライオ電子顕微鏡解析を進めた。今年度は特にアダプタータンパク質との結合状態での解析を重点的に行った。まず、TLR3のアダプタータンパク質であるTRIFの発現系の構築と精製方法を確立した。精製したTRIFがTLR3全長試料とRNA依存的に相互作用することを確認した。このTLR3全長、dsRNA、TRIFから構成される試料についてクライオ電子顕微鏡を用いて構造解析を進めた。しかし、これまでのTLR3全長とdsRNA複合体試料と同様に、dsRNAによって二量体化したTLR3の細胞外ドメインは明瞭に確認できたが、膜貫通領域および細胞内ドメインやTRIFの構造は可視化できなかった。このことは、TLR3の細胞外ドメインが膜に対して柔軟性を有していることを示唆する。TLR3全長の細胞外及び細胞内を同時に可視化するためには、TLR3の細胞外ドメインと膜貫通領域の間の柔軟性を制限する方法を検討する必要がある。
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