| 研究課題/領域番号 |
19H03169
|
|---|
| 研究機関 | 首都大学東京 |
|---|
研究代表者 |
三島 正規 首都大学東京, 理学研究科, 准教授 (70346310)
|
|---|
| 研究分担者 |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
田岡 万悟 首都大学東京, 理学研究科, 准教授 (60271160)
藤原 俊伸 近畿大学, 薬学部, 教授 (80362804)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | SHARP / NMR / Xist / 構造解析 / リボプロテオミクス |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、長鎖ノンコーディングRNAであるXistによる染色体レベルでの転写抑制の分子レベルでの理解を目指し、XistとSHARPとの複合体の立体構造の解析を行い、遺伝子量補正における鍵となる分子間相互作用の構造基盤を確立することである。そのため多次元NMR、SAXS(X線小角散乱)、X線結晶構造解析を用いた構造解析を行う。またリボプロテオミクス（免疫沈降と質量分析）による細胞内での結合部位の解析、他の因子との関連の解析を並行して行う。
本年度は、まず種々の発現系を構築し、多次元NMR法によってNMR解析のための安定同位体標識タンパク質等の調製を行った。例えば、RRM23部分に関しては、良好なNMRスペクトルが得られており、NMR信号の帰属を完了した。化学合成したRNAを用いてSHARP/Xist複合体とRBM15/Xist複合体の再構成複合体試料を用いて、HSQCやNOESY、スピンラベル導入による常磁性緩和効果からの長距離情報から得られるドメイン配向情報から立体構造解析を進めた。並行して、XistのタンデムA-repeatのNMR構造解析も進めた。タンデムリピートでは、RNA-repeat間のダイナミクスによりRNA由来の信号が消失する、あるいは信号の激しい重複を起こす等の困難さが想定されるので、複合体の解析に先立ち、RNA側のスペクトル、構造情報を取得しておくことは有効であると考え、RNA単体でのスペクトルの解析をすすめた。また、リボプロテオミクスにより最適な結合RNA配列の同定を並行して行うため、Xistに対する解析システムの構築に取り掛かった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
スピンラベルの導入には、部位特異的非天然アミノ酸導入とクリックケミストリーを用いて行う方法を採用する。定法である、システインを変異導入し、そのチオール基に対してスピンラベルを行うやりかたでは、内在性のシステインの存在が問題（アラニン変異等によるチオール基の消去の手間と、タンパク質への影響）になるが、部位特異的非天然アミノ酸導入ではそのような問題は生じず、作業を効率良く進めることができる。この部位特異的非天然アミノ酸導入とクリックケミストリーによる方法を確立できた。またマルチドメインでの解析に必要なドメイン選択的標識のためのsortaseによるドメイン連結法を確立できた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
SHARP/Xist複合体を目的の中心に据えて、X線結晶構造解析に加えて、溶液状態の構造解析手法であるNMRやSAXSを用いて構造解析を行う。またXist上のSHARP結合サイト、第三の因子の関与についてリボプロテオミクスを進める。得られた結合サイトの情報に基づいて、構造解析に用いるA-repeatの長さ、配列等をさらに検討する。構造解析ではタンパク質やRNAの長さ等の微妙な差が、試料の性質に大きな影響を与え、解析の成否をしばしば左右することから、リボプロテオミクスの情報をもとに、試料（特にRNAの長さ、配列）の検討を行うことで、結晶化の困難さを乗り越える。
|
