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本研究では、1細胞以下の細胞内区画や細胞小器官などの検体に存在する超微量RNAの全長配列を高感度に捉えるために、cDNA変換の精緻化及びcDNA全長配列のハイスループットな検出方法の開発を行っている。今年度は、poly-A taggingによるcDNA変換の精緻化において、以下の知見を得た。まず、逆転写酵素の種類と反応条件によって、シーケンサーで検出されるRNA分子数やrRNAの混入率が変化することを見出した。一方でcDNAの長さに関しては、大きな影響は認められなかった。またpoly-A taggingの効率を上昇させる因子をqPCRなどによるスクリーニング系で発見を試みた。poly-A tagging反応で使用する核酸の塩基アナログ条件から、効率を上昇させる候補因子を複数見出した。また、反応の緩衝液の種類によってcDNA長が改善することも見出した。次に、長鎖シーケンサーにおける検出方式を検討した。同検出には、両末端に異なるアダプター配列がつくことが望ましい。汎用的に使用されているアダプターを含めて、トランスクリプトーム解析に及ぼす影響を調べた。アダプター配列の組み合わせによっては、短鎖シーケンスにおけるトランスクリプトーム配列の読み始めにアダプターが混入するなどの問題が示唆された。これは、シーケンスライブラリDNA作製の工程の最適化によって大幅に軽減できたが、完全には解決できなかった。そこで、最適なアダプター配列の組み合わせをスクリーニングして、3種類の候補を得た。これにより、異なる両末端アダプター配列を通じて、特定の配列を付与し任意の順番にDNAを結合できる目処がたった。長鎖シーケンス解析では、ONT社のQ20+キットを使用することで、20塩基に1塩基のエラー程度のシーケンス品質で、これまでの2倍程度の正確性で全長cDNAの解析ができるようになった。
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