| 研究課題/領域番号 |
19H03222
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡本 浩二 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (40455217)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / オートファジー / 小胞体膜タンパク質挿入経路 / ホスファターゼ / テイルアンカータンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では出芽酵母をモデル生物に用いて、余剰または不良ミトコンドリアの丸ごと分別・除去機構、「マイトファジー」の素過程を分子レベルで解明するとともに、その普遍性と多様性を理解することを目的としている。これまでの研究で、小胞体に局在する膜タンパク質のうち、C末端付近に膜貫通ドメインを一つ持つテイルアンカー（TA）タンパク質の小胞体膜挿入を促進するタンパク質複合体Get1/2の欠損により、マイトファジーが強く抑制されること、マイトファジー駆動タンパク質Atg32のリン酸化が減少すること、マイトファジーを負に制御するタンパク質ホスファターゼPpg1との二重欠損でマイトファジーが回復することがわかった。Ppg1は、小胞体のTAタンパク質Far9を含むFar複合体と相互作用していることが報告されている、以上の知見から、Get1/2の欠損株ではPpg1-Far複合体が小胞体に繋留されず、Atg32の脱リン酸化を亢進させ、マイトファジーの抑制を引き起こしていると考えられる。
Atg32のリン酸化は、選択的オートファジーの鍵因子Atg11との相互作用を安定化することで、マイトファジーを促進していることがわかっている。本年度の研究において、Get1/2単独欠損およびPpg1との二重欠損株を調べたところ、Atg32-Atg11相互作用が前者で低下し、後者で野生株並みに回復することがわかった。また、Get1/2とFar9の二重欠損株でも、同様の表現型が得られた。そこで、Ppg1-Far複合体にGFPを付加し、細胞内局在を調べたところ、野生株では概ね小胞体に局在しているのに対し、Get1/2欠損細胞ではほとんどミトコンドリアに局在することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの解析から、Ppg1-Far複合体はGet1/2を介して小胞体に局在すること、Get1/2欠損でPpg1-Farがミトコンドリアへ標的化され、Atg32をより効率的に脱リン酸化することで、Atg32-Atg11相互作用が不安定化し、その結果としてマイトファジーが低下すると考えられる。重要なことに、このマイトファジー抑制は、Ppg1の不活性型変異タンパク質の発現でキャンセルされる。また、Ppg1-FarをGet1/2非依存的に小胞体へ繋留することで、Get1/2欠損細胞のマイトファジーが野生株並みに回復することもわかった。なお、Ppg1の酵素活性は、Ppg1-Far複合体の野生株での小胞体局在にも、Get1/2欠損細胞でのミトコンドリア局在にも、必要ないことを確認している。
このように、Get1/2欠損細胞のマイトファジー抑制が、Ppg1-Far複合体のミトコンドリア局在に起因していることが裏付けられたといえる。一方、野生型細胞でも、Ppg1-Far複合体の一部がミトコンドリアに局在し、Atg32を脱リン酸化することで、マイトファジーを負に制御している可能性があるが、小胞体のPpg1-Far複合体も同様の機能を持つのかについては、まだわかっていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究から、Atg32-Atg11相互作用にGet3が重要であることを見出した。Get3は細胞質に局在するATPaseであり、Get1/2を介した小胞体へのタンパク質の膜挿入を促進することが知られている。Get3を欠損した酵母細胞では、Atg32のリン酸化を負に制御するPpg1-Far複合体がミトコンドリアへ標的化し、Atg32を脱リン酸化することで、Atg32-Atg11相互作用を抑制すると考えられる。一方、Get3欠損ではマイトファジーはわずかに低下するだけなのに対し、Get3 Msp1二重欠損ではマイトファジーが著しく低下することを偶然見出した。Msp1はミトコンドリア外膜にアンカーされたAAA型ATPaseであり、ミトコンドリア外膜に誤局在したタンパク質を引き抜いて除去することが知られている。なお、Msp1欠損細胞のマイトファジーは野生株同様である。このように、出芽酵母のマイトファジーにおいて、Msp1がどのように関与しているのかは、よくわかっていない。
そこで、今後の研究において、Get3 Msp1二重欠損細胞におけるマイトファジー不全の分子機序を明らかにしてゆく。具体的には、(1) Msp1欠損細胞のAtg32-Atg11相互作用およびPpg1-Far複合体の局在を調べる。(2) Get3およびMsp1のATPase活性を失った変異体を発現させた細胞について、Atg32-Atg11相互作用・Ppg1-Far複合体局在・マイトファジーを解析する。(3) Get3 Msp1二重欠損のマイトファジーがPpg1欠損で回復するかどうか検証する。
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