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前年度までに、ミヤコグサのNIN-LIKE PROTEIN (NLP) 転写因子LjNLP1、LjNLP4が高濃度の硝酸存在下で根粒共生の成立に必須な過程を多面的にコントロールすることを明らかにしている。根粒菌との共生初期過程におけるRNA-seq解析を行い、根粒形成の正の制御転写因子NINの標的遺伝子の発現の多くがLjNLP1およびLjNLP4依存的に硝酸によって抑制されることがわかった。LjNLP4についてはDAP-seqを行い、LjNLP4の結合配列をゲノムワイドに同定し、さらにRNA-seqの結果と組み合わせることによりLjNLP4の標的遺伝子を特定した。さらに、SEC-MALS解析により、LjNLP4とNINはダイマーとして存在することを明らかにした。さらに、ゲルシフトアッセイによってDNA配列特異的にLjNLP4とNIN がホモまたはヘテロダイマーを形成することを明らかにした。また、ミヤコグサの葉肉細胞由来のプロトプラストを単離・形質転換する手法を開発した。この手法を用いてトランスアクチベーションアッセイを行い、LjNLP4が硝酸依存的にNIN標的遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。
前年度までに解析を進めていた硝酸により発現が誘導される新規ペプチドファミリー遺伝子について、過剰発現体の解析から機能解析を進める遺伝子を2つに絞り込んだ。この2つの遺伝子は冗長的に働くことが予想されたため、CRISPR-Cas9により2遺伝子を同時に機能喪失する個体の作製を行い、目的のノックアウト体を得ることに成功した。
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