| 研究課題/領域番号 |
19H03251
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
塚越 啓央 名城大学, 農学部, 准教授 (30594056)
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| 研究分担者 |
志水 元亨 名城大学, 農学部, 准教授 (20423535)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 側根発達 / 転写ネットワーク / イメージング / VLCFA / 概日リズム |
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| 研究実績の概要 |
側根形成を細胞の脱分化から再分化への変換を捉えるモデルとして、極長鎖脂肪酸(VLCFA)をシグナル分子として利用する新たな細胞分化の分子メカニズムの存在を明らかにすることを本研究の目的とする。本研究の開始前までに、VLCFAが時計遺伝子の発現に影響を与えること、時計遺伝子以外の遺伝子群(以下、選抜遺伝子とする)を見出している。この研究目的を達成するためにVLCFAシグナルを1)入力、2)伝達、3)出力の３段階にわけ、それぞれの段階をイメージング、分子遺伝学、遺伝子発現解析を中心に行い明らかにする。
1)の入力に関わるLipid Transfer Protein (LTP)のVLCFAへの結合特性を決定し、LTPと細胞膜上で結合する相互作用候補因子との結合アッセイをBiFCを用いて行なった。2)の伝達ではVLCFA量が低下した変異体を用いた発現解析を行い、昨年度まで進めていた時計変異株とは異なるVLCFAの量の変化に応答する転写因子の探索を進めた。また、それらの因子とオーキシンとの関連も調査した。3)の出力では時計遺伝子変異株や選抜遺伝子の遺伝子破壊株を用いた側根発達に関わる表現型の解析、それらのプロモーターレポーターラインの側根発達段階でのイメージング解析を進めた。また、VLCFA量の変化自体も捉えることが重要と考え、VLCFA生合成に関わる変異株をいくつか獲得し、それらの側根発達の表現型を調べた。
シグナル伝達経路の研究においては、異なるシグナル間でのクロストークやフィードバック制御が重要となる。そこで、LTP、時計遺伝子群、選抜遺伝子群、VLCFA生合成酵素遺伝子破壊株の根を用い、研究分担者とともにGC/MSによるVLCFAの量の変化や分子種の変化の解析を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1)入力: 昨年度までに絞り込んだLTPとの相互作用候補タンパク質との相互作用をプロトプラストを用いたBiFC法によって調べた。その結果、LTPとその候補タンパク質との相互作用を確認することができた。さらにその候補タンパク質遺伝子破壊株を取得し、LTPとの二重変異株の作成を進める予定である。
2)伝達: 令和元年度に内性のVLCFA量の変化が側根発達に重要であることを見出したので、VLCFA合成変異株を用いたRNAseq解析を行なった。VLCFA合成阻害剤処理した根を用いたRNA-seq解析との比較解析を行い、VLCFA量の低下によって発現量が顕著に上昇する新たな転写因子を見出した。この転写因子をVLCFA Response Transcription Factor 1 (VRTF1)と名づけ、その遺伝子破壊株を取得した。VRTF1変異株では側根数が増加していることがわかった。以上のことから伝達に関わる時計因子とは異なる新規の転写因子の同定ができた。
また、時計因子の概日リズムがVLCFA量の低下により短周期化することもわかった。
3)出力: 令和元年度に作成した各種レポータラインと変異株の掛け合わせ株を用いて、オーキシンとVLCFA、時計因子との関連を調べた。その結果、VLCFAの低下はさほどオーキシンの側根原基での蓄積に影響を与えないこと、時計因子も同様に側根原基付近のオーキシンの蓄積に影響を与えないことがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度に作成したリソースや結果をもとにVLCFAによる側根発達に関わる分子メカニズムを明らかにし、論文としてまとめる。
1)入力：LTPと相互作用する候補膜タンパク質を同定することができたので、その膜タンパク質の機能の詳細な解析を進める。VLCFA量が低下した植物ではそのタンパク質の発現自体は変化していないので、LTPがVLCFAを受容した時にその膜タンパク質が機能すると考えられる。この仮説を証明するために膜タンパク質変異株を用いた分子遺伝学解析を進める。
2)伝達：令和2年度に獲得したVRTF1と側根発達に関わる分子メカニズムの詳細な解析を進める。VRTF1変異株を用いてRNAseqを行いその標的因子を探索する。同時にデータベースを用いてVRTF1が結合するDNA領域を見出す。これらの解析を統合することにより、VRTF1が支配する転写ネットワークを書き出す。
また、時計因子がどのように側根発達に関わるかその詳細を調べる。令和2年度にVLCFAの低下が概日リズムを短周期化することがわかったので、時計因子の中でもどのような時計因子が特に重要かレポーターを用いた解析を進める。
3)出力：オーキシンとVLCFAの関係はあまり強く見られなかったので、VRTF1の下流因子並びに時計因子の下流因子がどのように側根の発達に関わるか調べる。2)で見出したVRTF1の下流因子に特に着目する。また、VRTF1がVLCFA合成にフィードバック制御をかける可能性もあるので、研究分担者とともにVRTF1のVLCFA量を測定しその可能性を探る。
1)から3)までの結果、特にVRTF1の関わる側根発達に関するデータを統合し、論文としてまとめVLCFAをシグナルとする新たな側根発達メカニズムを発表する。
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