研究課題
植物細胞壁の主要成分のペクチンは、植物の生育に欠かせない多糖で、非常に複雑な構造をしている。その生合成には約30の糖転移酵素が関わると考えられている。しかし、ほとんどの糖転移酵素遺伝子が未同定なままで、ペクチンの機能解析も進んでいない。本研究では、ペクチンの構成多糖、ラムノガラクツロナンI（RG-I）およびラムノガラクツロナンII（RG-II）生合成に関わる糖転移酵素（ペクチンRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素、ペクチンRG-I側鎖生合成ガラクトース転移酵素、ペクチンRG-II側鎖アピオース転移酵素、ペクチンRG-II側鎖Kdo転移酵素など）に焦点を当て、それらの遺伝子を同定することを第一の目的とする。遺伝子同定した糖転移酵素について、遺伝子発現抑制変異体の解析によりペクチンの機能解明を行うこと目指す。2020年度は、このうち1つの酵素を対象に研究し、以下の成果を得た。ペクチンRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素の遺伝子を同定した。MUCI70という種子保護多糖の合成に関わることがわかっていた遺伝子があり、糖転移酵素様のアミノ酸配列を持っていること、既知のガラクツロン酸転移酵素に若干の相同性が見られたことから、この遺伝子に着目した。この遺伝子がコードするタンパク質を哺乳動物細胞HEK293F細胞にて発現させ、本酵素活性を検出した。この遺伝子は、当研究室が以前に同定したもう一つのRG-I主鎖生合成に関わるラムノース転移酵素と共発現していた。新規の糖転移酵素ファミリーに属するものであった。現在、この酵素の生化学的解析や他の糖転移酵素とのアミノ酸配列比較解析、他の糖転移酵素との共発現解析などを詳細に進め、ペクチンRG-I生合成における役割を明らかにする実験を行なっている。
2: おおむね順調に進展している
植物細胞壁多糖ペクチンの生合成に関わる糖転移酵素の遺伝子を同定する本研究において、2020年度は、ペクチンRG-I主鎖生合成に関わるガラクツロン酸転移酵素を対象に研究し、以下の成果を得た。ペクチンRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素の遺伝子を同定した。シロイヌナズナ種子保護多糖はRG-I主鎖のみから構成されるため、種子保護多糖の形成過程で発現が上昇する遺伝子群の中に当該遺伝子があると予想した。シロイヌナズナの種子形成過程のマイクロアレイデータを参照して、保護多糖が形成される種子の形成過程後期で、発現が極端に上昇する遺伝子のうち、糖転移酵素様遺伝子で機能が未知な遺伝子を選抜した。選抜した遺伝子の塩基配列は、既知のガラクツロン酸転移酵素遺伝子のものに若干の相同性が見られた。この遺伝子がコードするタンパク質を哺乳動物細胞HEK293F細胞にて発現させ、分泌させた。このタンパク質を精製し、ペクチンRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素の基質を作用させたところ、本酵素活性を検出した。すなわち、この遺伝子をペクチンRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素の遺伝子として同定した。この遺伝子は、当研究室が以前に同定したもう一つのRG-I主鎖生合成に関わるラムノース転移酵素と共発現していた。また、同定したRG-I主鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素は、新規の糖転移酵素ファミリーに属するものであった。現在、この酵素の生化学的解析と、この遺伝子の相同遺伝子の解析を進めている。
ペクチン生合成酵素のうち、今回遺伝子同定したRG-I側鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素について、さらなる解析を進める。さらに、RG-II側鎖生合成Kdo転移酵素、RG-II側鎖生合成アピオース転移酵素について、遺伝子同定に向けた研究を進める。【RG-I側鎖生合成ガラクツロン酸転移酵素】これまでにMUCI70に本酵素活性があることを見出した。この酵素遺伝子には、これを含めて8つの相同遺伝子がある。2022年度は、この8つの相同遺伝子がコードするタンパク質にガラクツロン酸転移酵素活性があるか調査する。またこれらの酵素の活性の違いについて調べそれぞれのペクチン合成に対する役割を解明する。【RG-II側鎖生合成Kdo転移酵素】Kdo転移酵素のドナー基質であるCMP-Kdoは非常に不安定な化合物であるため、市販されていない。そこで、本研究では、CMP-Kdoの安定化条件を見出し、RG-II側鎖生合成Kdo転移酵素の基質として用いることができるようにする。また、シロイヌナズナゲノムより、この酵素の候補遺伝子を選抜する。CMP-Kdoの合成に関わる数種類の酵素と共発現する糖転移酵素様遺伝子を選抜していく。【RG-II側鎖生合成アピオース転移酵素】これまでに、本酵素のドナー基質であるUDP-アピオースを調製した。UDP-アピオースの生合成に関わる複数の酵素と共発現する糖転移酵素様遺伝子をRG-II側鎖生合成アピオース転移酵素の候補遺伝子として選抜する。
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