| 研究課題/領域番号 |
19H03253
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| 研究機関 | 岡山理科大学 |
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研究代表者 |
林 謙一郎 岡山理科大学, 理学部, 教授 (30289136)
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| 研究分担者 |
笠原 博幸 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00342767)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | オーキシン / 不活性化 / 代謝経路 |
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| 研究実績の概要 |
植物ホルモン・オーキシンの細胞，組織・器官での濃度制御は，オーキシンの代謝不活性化によって精緻に制御を受けており，そのことからオーキシンの不活性化の調節は植物の分化・成長においてきわめて重要である。これまでオーキシンであるindole 3-acetic acid (IAA)は，酸化経路（DAO経路）とアミノ酸複合体化経路（GH3経路）の2つの独立した経路で不活性化を受けると提唱されてきた。GH3酵素が触媒するIAAのアミノ酸複合体化と，DAO酵素が触媒するIAAの酸化について，我々は，GH3とDAO酵素が直線状に配置された経路でIAAが代謝されるとの仮説をたてた。すなわち，IAAはGH3酵素によって，IAA－アスパラギン酸やIAA－グルタミン酸へと不活性化されたのち，DAO酵素が，これらIAA-アミノ酸複合体を基質としてoxIAA-アミノ酸複合体へと酸化すると推定した。
オーキシンの代謝不活性化経路GH3-DAO経路を証明することで，オーキシンホメオスタシスの分子基盤を形成する代謝経路の全貌解明を目的として、研究に着手した。本研究課題では、IAA-アミノ酸複合体化を担う酵素である8種のGH3酵素と酸化経路（DAO経路）を担うとされているDAO1、DAO2の2種の酵素の過剰発現体や欠失変異体，多重変異株の構築に加えて，大腸菌でGH3組換え酵素とDAO組換え酵素を調製し，それら酵素の基質特異性とカイネテックについて検討した。DAO1酵素は従来IAAの酸化酵素と考えられていたが，我々の酵素活性の解析から，DAO1酵素はIAA-アミノ酸を基質として酸化し，oxIAA-アミノ酸を与える酸化酵素であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
IAA不活性化経路の再構築研究にあたり、（１）「GH3酵素阻害剤・細胞膜透過性IAA-アミノ酸誘導体の合成と評価」（２）「代謝酵素の欠失変異株・過剰発現体の作成と代謝中間体の精密定量」（3）「不活性化酵素の基質特異性」の三つの軸として研究を進めている。
（１）については，おおむね順調に進展している。（２）については，カルフォルニア大学との共同研究で、ゲノム編集による欠失を実施しているが，計画した欠失変異体のすべてを構築できなかった。一方，IAA代謝中間体のフィーディング実験とLC-MS/MSによる定量分析により，これら形質転換体におけるIAA代謝産物の定量は計画通り進展している。（３）大腸菌でのDAO組換え酵素の過剰発現に成功し，基質特性を解析することができた。この研究計画のカギとなる実験データーを得ることに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画しているオーキシン代謝酵素すべての欠失変異株・過剰発現体のホモ個体を得て，それらの表現型の詳細な解析を実施する。また，変異体におけるIAA代謝中間体のLC-MS/MSによる精密定量を行うため，安定同位体の投与実験も試みる。ILL1-ILL6およびILR1,IAR3代謝酵素について無細胞タンパク合成系での酵素タンパク質の調製を進める。
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