ミトコンドリアDNAポリメラーゼの多様性と進化の全容解明

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03280
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 稲垣 祐司 筑波大学, 計算科学研究センター, 教授 (50387958)
• 研究分担者: 平川 泰久 筑波大学, 生命環境系, 助教 (40647319) ; 中野 賢太郎 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50302815) ; 石谷 佳之 筑波大学, 計算科学研究センター, 研究員 (60772043)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: ミトコンドリア / DNA複製 / 真核生物系統 / DNAポリメラーゼ / オルガネラ進化 / ユーグレノゾア / DNAポリメラーゼI

研究実績の概要

ユーグレノゾア生物群は主に、①トリパノソーマ原虫をふくむキネトプラスト類、②ディプロネマ類、③ミドリムシをふくむユーグレナ類から構成される。我々はユーグレノゾアにふくまれる生物種の大規模配列データ中にミトコンドリア局在DNAポリメラーゼ（mt局在DNA pol）を探索した。その結果、ユーグレノゾアにおいては既知のmt局在DNA pol（POP、PolIA、PolIB、PolIC、PolID）に加え、異なる2種類の新奇mt局在DNA polが検出され、複数種類のmt局在DNA polが複雑に分布していた。ユーグレノゾア生物群の中でのキネトプラスト類、ディプロネマ類、ユーグレナ類の分岐順序を鑑みると、上記3系統の分岐に応じてmt局在DNA polのレパートリーが変化したと考えられる。
本研究計画が開始される前から、我々はヘテロロボサ類Naegrelia gruberiゲノム中に発見されたDNAポリメラーゼ（XP_002679000.1）を、新奇mt局在DNA polとして注目していた。2019年度の研究により、同じタイプのDNAポリメラーゼがアンキロモナス類、マラウィモナス類、ディスコバ生物群にも発見された。これらのDNAポリメラーゼN末端配列はミトコンドリア局在シグナルと予測された。
GenBankデータベースに登録されているディスコバ生物群にふくまれるTsukubamonas globosa、アンキロモナス類の配列データのクオリティが低く、注目するmt局在DNA pol候補タンパク全長を復元することができなかった。そこでTsukubamonasとアンキロモナス類Fabomonas sp.について、タンパク質全長の決定を目指し新たにRNA-seqデータを取得した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々の研究により、ユーグレノゾア生物群におけるmt局在DNA polの多様性は以下のように推測された。まずPolIAは上記3系統すべてから検出されたため、ユーグレノゾアの共通祖先でPolIAが確立したと考えられる。PolIBCDはキネトプラスト類特異的mt局在DNA polであること、一部の系統がこれまで認識されていなかったタイプのmt局在DNA polをもつことが判明した。ディプロネマ類は、キネトプラスト類のPolIBCDに進化的に近縁な新奇mt局在DNA polをもつことが明らかとなった。ディプロネマ類とキネトプラスト類は姉妹群関係にあるので、その共通祖先においてPolIAとは異なるmt局在DNA polが確立し、その後多様化したと推測できる。ディプロネマ類ともキネトプラスト類とも異なり、ユーグレナ類はmt局在DNA polとしてPOPをもつことが明らかとなった。この成果は、Pathogens誌に査読付き英文論文として発表した（原田らPathgens 2020 9:257）。
Naegleriaで発見された新奇mt局在DNA pol候補タンパク質の全長配列は、マラウィモナス類1種、ディスコバ生物群2種からも復元できた。これらのタンパク質のN末端アミノ酸配列と緑色蛍光タンパク（GFP）とを融合させ、酵母細胞内で発現させるためのベクター（pYX142-mtGFP）を作製した。また、全長配列が取得できなかったディスコバ生物の1種Tsukubamonasとアンキロモナス類Fabomonas sp.のRNA-seqデータから、新奇mt局在DNA pol候補タンパク質の全長配列を取得することに成功した。

今後の研究の推進方策

酵母の発現ベクター（pYX142-mtGFP）中で、新奇mt局在DNA pol候補タンパク質遺伝子の5’配列とGFP遺伝子を連結した。今後このベクターを酵母に導入し、融合タンパク質がミトコンドリアに輸送されるかを緑色蛍光で確認する。融合タンパク質がミトコンドリアに局在すれば、GFPに融合したN末端アミノ酸配列はミトコンドリア局在シグナルである、すなわち解析対象タンパク質がmt局在であると解釈できる。TsukubamonasとFabomonasのmt局在DNA pol候補タンパク質については、RNA-seqデータから完全長タンパク質配列が復元できたが発現ベクターの作製には取り掛かっていない。この2配列についても、発現ベクターの作成、酵母細胞内でのGFP融合タンパク質の発現と局在解析を行う。すべての酵母細胞内発現解析が終わった段階で、英文論文の執筆に取り掛かる。
これまで広範な真核生物系統からmt局在DNA polを探索してきたが、マラリア原虫をふくむアピコンプレクサ生物群においては既知のmt局在DNA polは発見できていない。これまでに知られている全てのmt局在DNA polは、進化的に細菌DNAポリメラーゼI（PolI）に近縁である。そこでPolIへのアミノ酸配列相同性を指標に、熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumなどのゲノム・転写物データ中に新奇mt局在DNA pol候補を探索する。候補配列を検出できた場合、細胞内局在を確認する実験を計画・実施する。

研究成果

• [国際共同研究] Charles University(チェコ)
  • 国名: チェコ
  • 外国機関名: Charles University
• [雑誌論文] Inventory and Evolution of Mitochondrion-localized Family A DNA Polymerases in Euglenozoa (2020)
  • 著者名/発表者名: Ryo Harada, Yoshihisa Hirakawa, Akinori Yabuki, Yuichiro Kashiyama, Moe Maruyama, Ryo Onuma, Petr Soukal, Shinya Miyagishima, Vladimir Hampl, Goro Tanifuji, Yuji Inagaki,
  • 雑誌名: Pathogens 巻: 9 ページ: 257
  • DOI: 10.3390/pathogens9040257
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Dinoflagellates with relic endosymbiont nuclei as models for elucidating organellogenesis (2020)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Sarai, Goro Tanifuji, Takuro Nakayama, Ryoma Kamikawa, Kazuo Takahashi, Euki Yazaki, Eriko Matsuo, Ken-ichiro Ishida, Mitsuhisa Iwataki, Yuji Inagaki
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 117 ページ: 5364-5375
  • DOI: 10.1073/pnas.1911884117
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparative plastid genomics of Cryptomonas species reveals fine-scale genomic responses to loss of photosynthesis (2020)
  • 著者名/発表者名: Goro Tanifuji, Ryoma Kamikawa, Christa E Moore, Tyler Mills, Naoko T Onodera, Yuichiro Kashiyama, John M Archibald, Yuji Inagaki, Tetsuo Hashimoto
  • 雑誌名: Genome Biology and Evolution 巻: 12 ページ: 3926-3937
  • DOI: 10.1093/gbe/evaa001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Barthelonids represent a deep-branching Matamonad clade with mitochondrion-related organelles generating no ATP (2019)
  • 著者名/発表者名: Euki Yazaki, Keitaro Kume, Takashi Shiratori, Yana Eglit, Ryo Harada, Alastair GB Simpson, Ken-ichiro Ishida, Tetsuo Hashimoto, Yuji Inagaki
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 2019 ページ: -
  • DOI: 10.1101/805762v1
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Large DNA virus promoted the endosymbiotic evolution to make a photosynthetic eukaryote (2019)
  • 著者名/発表者名: Mitsuhiro Matsuo, Atsushi Katahara, Makoto Tachikawa, Yohei Miakuchi, Hideki Noguchi, Atsushi Toyoda, Asao Fujiyama, Yutaka Suzuki, Takayuki Hata, Soichirou Satoh, Takuro Nakayama, Ryoma Kamikawa, Mami Nomura, Yuji Inagaki, Ken-ichiro Ishida, Junichi Obokata
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 2019 ページ: -
  • DOI: 10.1101/809541
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-cell genomics unveiled a cryptic cyanobacterial lineage with a worldwide distribution hidden by a dinoflagellate host (2019)
  • 著者名/発表者名: Takuro Nakayama, Mami Nomura, Yoshihito Takano, Goro Tanifuji, Kogiku Shiba, Kazuo Inaba, Yuji Inagaki, Masakado Kawata
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 116 ページ: 15973-15978
  • DOI: 10.1073/pnas.1902538116
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] エンドヘレア太陽虫Microheliella marisの系統的位置とミトコンドリアゲノム． (2020)
  • 著者名/発表者名: 矢吹彬憲, 矢﨑裕規, 今泉彩香, 白鳥峻志, 久米慶太郎, 橋本哲男, 稲垣祐司
  • 学会等名: 日本藻類学会第44回大会
• [学会発表] 緑色渦鞭毛藻 Oxytoxum sp. SG-436株 の共生藻痕跡核のゲノム解析． (2020)
  • 著者名/発表者名: 川久保卓志, 松尾恵梨子, 高橋和也, 谷藤吾朗, 岩滝光儀, 稲垣祐司
  • 学会等名: 日本藻類学会第44回大会
• [学会発表] ディスコバ生物群，マラウィモナス類，アンキロモナス類が保持する新奇ミトコンドリア局在DNAポリメラーゼ． (2020)
  • 著者名/発表者名: 原田亮, 中野賢太郎, 矢吹彬憲, 白鳥峻志, Ensoo Kim, 稲垣祐司
  • 学会等名: 日本藻類学会第44回大会
• [学会発表] 有孔虫の大規模分岐年代推定． (2020)
  • 著者名/発表者名: 石谷佳之, 矢﨑裕規, 氏家由利香, 稲垣祐司
  • 学会等名: 日本古生物学会2020年大会
• [学会発表] Phylogenomic analyses unveiled multiple endosymbioses of pedinophycean green algae in distantly related dinoflagellates． (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuji Inagaki
  • 学会等名: 2019 CCS-EPCC Workshop
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] フィロジェノミック解析により推測されたMicroheliella marisの系統的位置． (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢﨑裕規, 今泉彩香, 久米慶太郎, 白鳥峻志, 橋本哲男, 矢吹彬憲, 石田健一郎, 稲垣祐司
  • 学会等名: 第3回日本共生学会大会
• [学会発表] 有孔虫Ammonia beccariiのミトコンドリアに局在するDNA分子群． (2019)
  • 著者名/発表者名: 石谷佳之, 久米慶太郎, 稲垣祐司．
  • 学会等名: 第3回日本共生学会大会
• [学会発表] 真核生物におけるSMCタンパクファミリーの多様化と二次的喪失． (2019)
  • 著者名/発表者名: 吉永真理, 稲垣祐司
  • 学会等名: 第52回日本原生生物学会大会
• [学会発表] ユーグレノゾアにおけるミトコンドリア局在DNAポリメラーゼの進化． (2019)
  • 著者名/発表者名: 原田亮, 平川泰久, 矢吹彬憲, 柏山祐一郎, 丸山萌, 大沼亮, Vlademir Hampl, 谷藤吾朗, 稲垣祐司
  • 学会等名: 第52回日本原生生物学会大会
• [学会発表] ゼロから始める大規模分子系統解析． (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢﨑裕規, 稲垣祐司
  • 学会等名: 第52回日本原生生物学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] 翻訳終結因子Cドメインにみられる部分的欠失の進化とタンパク質機能・構造に与える影響． (2019)
  • 著者名/発表者名: 上原忠晃, 栢沼愛, 重田育照, 稲垣祐司
  • 学会等名: 第52回日本原生生物学会大会
• [学会発表] Dinoflagellates as the model for the evolution of eukaryotic cells and genomes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuji Inagaki
  • 学会等名: National Taiwan University-University of Tsukuba Bilateral Symposium on Life Science
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ATG12-ATG5における非共有結合非依存化の普遍性について． (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢﨑裕規, 坂本寛和, 上原忠晃, 稲垣祐司, 山本林, 水島昇
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] Re-exploration of the protein performing plant-type C-to-U RNA editing in diverse eukaryotes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuki Nishimura, Nagisa Sato, Yoshiyuki Ishitani, Takashi Shiratori, Ken-ichiro Ishida, Tetsuo Hashimoto, Yuji Inagaki, Moriya Ohkuma
  • 学会等名: 14th International Colloquium on Endocytobioogy and Symbiosis
  • 国際学会
• [学会発表] 新奇真核微生物の探索と細胞内共生に伴う宿主ゲノムの進化：真核生物初期進化の理解に向けて． (2019)
  • 著者名/発表者名: 稲垣祐司
  • 学会等名: KCCセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Distribution of plant-type mitochondrial C-to-U RNA editing in diverse eukaryotes. (2019)
  • 著者名/発表者名: 西村祐貴, 佐藤渚, 白鳥峻志, 石田健一郎, 橋本哲男, 稲垣祐司, 大熊盛也
  • 学会等名: 日本進化学会第21回大会
• [学会発表] A novel type of mitochondrion-localized DNA polymerase unites 'orphan eukaryotes' into a new 'super-group'. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ryo Harada, Kentaro Nakano, Akinori Yabuki, Yuji Inagaki
  • 学会等名: 日本進化学会第21回大会
• [学会発表] Single-cell genomics unveiled a cryptic cyanobacterial lineage with a worldwide distribution hidden by a dinoflagellate host. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takuro Nakayama, Mami Nomura, Yoshihito Takano, Kogiku Shiba, Kazuo Inaba, Goro Tanifuji, Yuji Inagaki, Masakado Kawata
  • 学会等名: CWRU-TOHOKU Joint Work Shop
  • 国際学会
• [学会発表] Evolutionarily distinct gene-sets for autophagosome formation in dinoflagellate harboring diatom endosymbionts. (2019)
  • 著者名/発表者名: Euki Yazaki, Tadaaki Uehara, Hirokazu Sakamoto, Tetsuo Hashimoto, Noboru Mizushima, Yuji Inagaki
  • 学会等名: VIII European Congress of Protistology
  • 国際学会
• [学会発表] Phylogenomic analysis assessing the position of "orphans" including Microheliella maris. (2019)
  • 著者名/発表者名: Euki Yazaki, Ayaka Imaizumi, Keitaro Kume, Takashi Shiratori, Tetsuo Hashimoto, Akinori Yabuki, Ken-ichiro Ishida, Yuji Inagaki.
  • 学会等名: VIII European Congress of Protistology
  • 国際学会
• [学会発表] Genome analysis of a symbiotic nitrogen-fixing cyanobacterium in a pelagic dinoflagellate, Histioneis depressa. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takuro Nakayama, Mami Nomura, Yoshihito Takano, Kogiku Shiba, Kazuo Inaba, Goro Tanifuji, Yuji Inagaki, Masakado Kawata
  • 学会等名: VIII European Congress of Protistology
  • 国際学会
• [学会発表] 有中心粒太陽虫類におけるミトコンドリアゲノムの比較解析. (2019)
  • 著者名/発表者名: 西村祐貴, 佐藤渚, 白鳥峻志, 石田健一郎, 橋本哲男, 稲垣祐司, 大熊盛也
  • 学会等名: 日本微生物資源学会第26回大会