シナプス伝達効率を調節するアクティブゾーンの分子構造基盤と修飾機構

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03324
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 大塚 稔久 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40401806)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: アクティブゾーン / CAST / Bassoon

研究実績の概要

AAV (Adeno associated virus)-GFP-CAST-BirAを用いた感染実験をスタートさせるために、各種のコンストラクションの作成を行った。特に、ビオチンリガーゼ・BirAとCASTのリンカーの長さを変えたコンストラクションを作成して、海馬初代培養神経細胞での発現・局在解析を進めた。トランスフェクション後にビオチンを追加し染色したところ、いずれのコンストラクトもビオチンシグナルは内在性のアクティブゾーンマーカーBassoonと共局在した。さらに、Bassoonとの局在を定量化したところ、リンカーの長さによってビオチンシグナルとBassoonのシグナルとの共局在の程度に統計学的に優位な差が見られた。このことは、リンカーの長さを変えることによってCASTからの距離に応じた異なる結合分子複合体を検出できることを示唆する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

マウス個体での条件検討までは進まなかったが、海馬初代培養細胞において詳細な条件検討を進めることができた。リンカーの長さは、ナノメートルオーダーの違いであるが、ビオチンシグナルに優位な違いが見られたことから、CASTからの距離の違いを反映した分子複合体の解析が可能となるデータを得られたため。

今後の研究の推進方策

得られたタンパク質群を性質や局在、発現パターン等でグルーピングして、年度の早い時期に、質量分析を行い、既知のものについては文献調査を進めて、CAST結合タンパク質の候補を抽出する。特に、CASTのanchoring タンパク質の候補として膜貫通タンパク質に着目する。次に、生化学的に相互作用した分子について、シナプスでの発現および局在を確認する。新規分子については抗体の作成を試みる。そして、プレシナプスに局在し、かつCASTに直接結合することが確認できた分子については、AAVを含む各種発現プラスミド等の作成をすすめリソースをそろえる。機能解析については、海馬初代培養細胞もしくは急性スライスにて、電気生理学的解析および細胞生物学的な局在解析を行う。特に、表現型が顕著なものについては、遺伝子改変マウスの作成を開始する。

研究成果

• [雑誌論文] Presynaptic development is controlled by the core active zone proteins CAST/ELKS. (2020)
  • 著者名/発表者名: Radulovic, T., Dong, W., Goral, R., Thomas, C., Veeraraghavan, P., Montesinos, M., Guerrero-Given, D., Goff, K., Luebbert, M., Kamasawa, N., Ohtsuka, T., Young, S.M.*
  • 雑誌名: J. Physiol. 巻: in press ページ: -
  • DOI: 10.1113/JP279736.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impaired experience-dependent maternal care in presynaptic active zone protein CAST-deficient dams. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara, A., Sugiyama, N., Ohtsuka, T.*
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 10 ページ: 5238
  • DOI: 10.1038/s41598-020-62072-1.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Double deletion of the active zone proteins CAST/ELKS in the mouse forebrain causes high mortality of newborn pups. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara, A., Hamada, S., Hida, Y., Ohtsuka, T.*
  • 雑誌名: Molecular Brain 巻: 13 ページ: 13
  • DOI: 10.1186/s13041-020-0557-x.2019.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] VPS13D-related disorders presenting as a pure and complicated form of hereditary spastic paraplegia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Koh, K., Ishiura, H., Shimazaki, H., Tsutsumiuchi, M., Ichinose, Y., Nan, H., Hamada, S., Ohtsuka, T., Tsuji, S., Takiyama, Y.
  • 雑誌名: Mol Genet Genomic Med. 巻: 8 ページ: e1108
  • DOI: 10.1002/mgg3.1108.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Role of the active zone protein, ELKS, in insulin secretion from pancreatic b-cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Imaizumi, M., Aoyagi, K., Ohtsuka, T.
  • 雑誌名: Mol Metab. 巻: 27S ページ: S81-S91
  • DOI: 10.1016/j.molmet.2019.06.017.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Vangl2 interaction plays a role in the proteasomal degradation of Prickle2. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nagaoka, T., Furuse, M., Ohtsuka, T., Tsuchida, K., Kishi, M.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 2912
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39642-z.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ELKS/Voltage-dependent Ca2+ channel-b Subunit Module Regulates Polarized Ca2+ Influx in Pancreatic β-Cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Imaizumi, M.*, Aoyagi, K., Hida, Y., Yoshida, M., Yamauchi, H., Ohkura, M., Abe, M., Akimoto, Y., Nakamichi, Y., Nishiwaki, C., Kawakami, H., Hara, K., Sakimura, K., Nakai, J., Kakei, M., Nagamatsu, S., Ohtsuka, T. *
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 26 ページ: 1213-1226
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2018.12.106.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Neuroimaging, genetic, and enzymatic study in a Japanese family with a GBA gross deletion. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, Y., Ishiura, H., Tanaka, M., Yoshimura, J., Doi, K., Umeda, T., Yamauchi, H., Tsuchiya, M., Koh, K., Yamashiro, N., Mitsui, J., Goto, J., Onishi, H., Ohtsuka, T., Shindo, K., Morishita, S., Tsuji, S., Takiyama, Y.
  • 雑誌名: Parkinsonism & Related Disorders 巻: 61 ページ: 57-63
  • DOI: 10.1016/j.parkreldis.2018.11.028.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] UBAP1 mutations cause juvenile-onset hereditary spastic paraplegias (SPG80) and impair UBAP1 targeting to endosomes (2019)
  • 著者名/発表者名: Nan Haitian、Ichinose Yuta、Tanaka Masaki、Koh Kishin、Ishiura Hiroyuki、Mitsui Jun、Mizukami Heisuke、Morimoto Masafumi、Hamada Shun、Ohtsuka Toshihisa、Tsuji Shoji、Takiyama Yoshihisa
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 64 ページ: 1055～1065
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0670-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Neuropsychopharmacology of relaxin-3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshihisa Ohtsuka
  • 学会等名: 第６回アジア神経精神薬理学会大会（AsCNP2019)
  • 国際学会
• [学会発表] シナプス分子間相互作用から捉える可塑性機構とその破綻 (2019)
  • 著者名/発表者名: 大塚稔久
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会・日本細胞生物学会合同年次大会
  • 招待講演
• [備考] 山梨大学医学部生化学講座第一教室ホームページ
  • URL: HP:http://www.med.yamanashi.ac.jp/basic/bioche01/