分岐型糖鎖の高次構造と相互作用原理の解明

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03362
• 研究機関: 東北医科薬科大学
• 研究代表者: 山口 芳樹 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (90323451)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 糖鎖 / 糖タンパク質 / NMR / 糖転移酵素 / 電子顕微鏡

研究実績の概要

1. 13C-NMR法による糖タンパク質の水素結合の解析
水素結合を直接観察する一つの手段としてNMR法が用いられている。1H-NMR法は糖鎖ヒドロキシ水素を直接観測する利点を有する一方で、シグナルの化学シフト範囲が狭く、他の信号と重複することが問題であった。本研究ではその問題を解決するため、広い化学シフト域を有する13C-NMRを用いて解析を行った。13C-NMR測定には分岐型高マンノース糖鎖を含むRNase Bをモデル糖タンパク質として、H2O : D2O = 1 : 1の溶媒を使用して行った。そして、糖鎖に由来する13C-NMRシグナルの線形の温度依存性を観察することにより、ヒドロキシプロトンのH/D交換速度に関する情報の抽出を試みた。その結果、高温ではsharpな13Cシグナルが観測された一方、低温においてはbroadな13Cシグナルが観察された。13C-NMRの感度の低さの問題は残されているものの、糖タンパク質糖鎖の水酸基に由来する水素結合の解析法として13C-NMR法の有効性を示した。
2. 分岐糖鎖を有するタンパク質と糖転移酵素との相互作用解析
分岐型糖鎖に作用する糖転移酵素UGGTの分子メカニズムを解明するため、糖転移酵素およびその補助因子の発現系構築を最初に検討した。細胞内に発現している糖転移酵素の抽出条件の最適化（超音波破砕の時間、可溶化剤の添加）を行い、糖転移酵素の一段階精製法を確立した。また補助因子の分泌発現・精製法を確立し、補助因子内のジスルフィド結合ペアを2組同定した。さらに、精製した糖転移酵素と補助因子を混合後、ゲルろ過カラムを用いて安定な複合体を単離することに成功した。その複合体をネガティブ染色後に2D解析を行ったところ、クライオ電顕で観察が見込める単分散の像を得ることができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

試薬の到着の遅れ・故障機器の修理の遅れなどはあったが、おおむね当初の計画目標を達成している。

今後の研究の推進方策

計算科学の基盤を整えるとともに、電子顕微鏡観察のための高濃度タンパク質試料を調製する。

研究成果

• [雑誌論文] 3D Structure and Function of Glycosyltransferases Involved in N-glycan Maturation (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagae Masamichi、Yamaguchi Yoshiki、Taniguchi Naoyuki、Kizuka Yasuhiko
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 21 ページ: 437～437
  • DOI: 10.3390/ijms21020437
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Annexin A4 inhibits sulfatide‐induced activation of coagulation factor XII (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakayama Moeka、Miyagawa Hitomi、Kuranami Yumiko、Tsunooka‐Ota Miyuki、Yamaguchi Yoshiki、Kojima‐Aikawa Kyoko
  • 雑誌名: Journal of Thrombosis and Haemostasis 巻: 18 ページ: 1357～1369
  • DOI: 10.1111/jth.14789
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Discovery of a new sialic acid binding region that regulates Siglec-7 (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamakawa Nao、Yasuda Yu、Yoshimura Atsushi、Goshima Ami、Crocker Paul R.、Vergoten Gerard、Nishiura Yuji、Takahashi Takashi、Hanashima Shinya、Matsumoto Kana、Yamaguchi Yoshiki、Tanaka Hiroshi、Kitajima Ken、Sato Chihiro
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 8647
  • DOI: 10.1038/s41598-020-64887-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Glucocerebrosidases catalyze a transgalactosylation reaction that yields a newly-identified brain sterol metabolite, galactosylated cholesterol (2020)
  • 著者名/発表者名: Akiyama Hisako、Ide Mitsuko、Nagatsuka Yasuko、Sayano Tomoko、Nakanishi Etsuro、Uemura Norihito、Yuyama Kohei、Yamaguchi Yoshiki、Kamiguchi Hiroyuki、Takahashi Ryosuke、Aerts Johannes M.F.G.、Greimel Peter、Hirabayashi Yoshio
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 295 ページ: 5257～5277
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.012502
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pick’s Tau Fibril Shows Multiple Distinct PET Probe Binding Sites: Insights from Computational Modelling (2020)
  • 著者名/発表者名: Mishra Sushil K.、Yamaguchi Yoshiki、Higuchi Makoto、Sahara Naruhiko
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 22 ページ: 349～349
  • DOI: 10.3390/ijms22010349
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Short disordered protein segment regulates cross-species transmission of a yeast prion (2020)
  • 著者名/発表者名: Shida Toshinobu、Kamatari Yuji O.、Yoda Takao、Yamaguchi Yoshiki、Feig Michael、Ohhashi Yumiko、Sugita Yuji、Kuwata Kazuo、Tanaka Motomasa
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 16 ページ: 756～765
  • DOI: 10.1038/s41589-020-0516-y
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Aspects of Carbohydrate Recognition Mechanisms of C-Type Lectins (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagae Masamichi、Yamaguchi Yoshiki
  • 雑誌名: Curr Top Microbiol Immunol 巻: 429 ページ: 147～176
  • DOI: 10.1007/82_2019_181
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A synopsis of recent developments defining how N-glycosylation impacts immunoglobulin G structure and function (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Yoshiki、Barb Adam W
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 30 ページ: 214～225
  • DOI: 10.1093/glycob/cwz068
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Chemical Synthesis of Residue-Selectively 13C and 2H Double-Isotope-Labeled Oligosaccharides as Chemical Probes for the NMR-Based Conformational Analysis of Oligosaccharides (2020)
  • 著者名/発表者名: Hamagami Hiroki、Yamaguchi Yoshiki、Tanaka Hiroshi
  • 雑誌名: The Journal of Organic Chemistry 巻: 85 ページ: 16115～16127
  • DOI: 10.1021/acs.joc.0c01939
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Contribution from Synthetic Organic Chemistry and Glycoscience to ADC Development: Homogeneous ADC Preparation and Development of Cancer Stromal Targeting Therapy (2020)
  • 著者名/発表者名: Manabe Shino、Yamaguchi Yoshiki、Matsumura Yasuhiro
  • 雑誌名: Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan 巻: 78 ページ: 485～494
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.78.485
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Dynamics Simulation of Glycans (2020)
  • 著者名/発表者名: Re Suyong、Yamaguchi Yoshiki、Sugita Yuji
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: 32 ページ: E113～E118
  • DOI: 10.4052/tigg.1616.1E
  • 査読あり
• [雑誌論文] Solid-state 17O NMR analysis of synthetically 17O-enriched D-glucosamine (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamada Kazuhiko、Yamaguchi Yoshiki、Uekusa Yoshinori、Aoki Kazumasa、Shimada Ichio、Yamaguchi Takumi、Kato Koichi
  • 雑誌名: Chemical Physics Letters 巻: 749 ページ: 137455～137455
  • DOI: 10.1016/j.cplett.2020.137455
  • 査読あり
• [雑誌論文] 糖鎖立体構造解析技術の開発要素 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口 芳樹
  • 雑誌名: 生化学 巻: 92 ページ: 369～377
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2020.920369
  • 査読あり
• [学会発表] 糖鎖構造の多様性の生物学的意義を求めて (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口 芳樹
  • 学会等名: 第16回機能性糖鎖研究会
  • 招待講演
• [学会発表] NMR analysis of glycolipid in aqueous solution (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Yamaguchi
  • 学会等名: International Symposium on Glyco-lipidologue
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 計算化学によるリビトールのコンフォメーション空間の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野 詩歩，真鍋 法義，山口 芳樹
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] 紫外線照射によるトリプトファン残基の化学構造変化 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真鍋 法義，星 憲司，大野 詩歩，山口 芳樹
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] 完全重水素化シクロデキストリンの酵素化学合成と糖脂質のNMR解析への応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口 芳樹，眞鍋 史乃，Peter Greimel，伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
  • 招待講演
• [学会発表] 糖鎖認識抗体によるエピトープ認識の分子基盤 (2020)
  • 著者名/発表者名: 川嵜 敏祐，中尾 広美，川嵜 伸子，築地 信，稲垣 優希，吉田 昌宏，山口 芳樹，天野 裕之，大野 詩歩，真鍋 法義
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
• [学会発表] 免疫グロブリンG結合糖鎖の立体構造データの調査 (2020)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 いずみ，大野 詩歩，真鍋 法義，山口 芳樹
  • 学会等名: 第14回東北糖鎖研究会
• [学会発表] 糖鎖認識抗体の設計を目指した特異的CDR配列の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 瀬川 千夏，真鍋 法義，大野 詩歩，山口 芳樹
  • 学会等名: 第14回東北糖鎖研究会
• [学会発表] 非環状糖リビトールの計算化学とNMRによる動的構造解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野 詩歩, 真鍋 法義, 山口 芳樹
  • 学会等名: 第14回東北糖鎖研究会
• [学会発表] コアフコース含有N-グリカンの機能解明・制御を目指したケミカルバイオロジー (2020)
  • 著者名/発表者名: 真鍋 良幸，MARCHETTI Roberta，武部 智之，笠原 里実，高倉 陽平，長崎 政裕，二瓶 渉，田中 克典，樺山 一哉，CHIODO Fabrizio，花島 慎弥，鎌田 佳宏，三善 英知，DULAL Hari Prasad，山口 芳樹，安達 禎之，大野 尚仁，田中 浩士，SILIPO Alba，MOLINARO Antonio，深瀬 浩一
  • 学会等名: 第62回天然有機化合物討論会
• [学会発表] 非環状の糖鎖成分リビトールの静的および動的構造の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野 詩歩，真鍋 法義，山口 拓実，鵜澤 洵，山口 芳樹
  • 学会等名: 第59回日本薬学会東北支部大会
• [学会発表] コアフコース含有N-グリカン認識レクチンの探索 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真鍋 良幸，MARCHETTI Roberta，高倉 陽平，長崎 政裕，二瓶 渉，武部 智之，田中 克典，樺山 一哉，CHIODO Fabrizio，花島 慎弥，鎌田 佳宏，三善 英知，DULAL Hari Prasad，山口 芳樹，安達 禎之，大野 尚仁，田中 浩士，SILIPO Alba，MOLINARO Antonio，深瀬 浩一
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会年会
• [学会発表] 抗糖鎖抗体の立体構造データベース構築と抗原結合部位の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 瀬川 千夏、真鍋 法義、大野 詩歩、山口 芳樹
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会年会
• [学会発表] NMR法と分子動力学計算による非環状糖リビトールの動的構造解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野 詩歩，真鍋 法義，山口 拓実，鵜澤 洵，山口 芳樹
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会年会
• [学会発表] プリオン感染における「種の壁」を解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 志田俊信，鎌足雄司，依田隆夫，山口芳樹，Michael Feig，大橋祐美子，杉田有治，桑田一夫，田中元雅
  • 学会等名: 第59回NMR討論会
• [学会発表] NMR approach to investigate glycan structure and function (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Yamaguchi
  • 学会等名: 14th Chandigarh Science Congress-2020 (CHASCON-2020)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] βグルカンの立体構造とその相互作用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口芳樹
  • 学会等名: 第4回東北医真菌研究会
  • 招待講演