| 研究実績の概要 |
これまでEP3-GiおよびGo,G13複合体、OX2R-Gi/o複合体について条件検討を重ね、安定な複合体条件を見出しており、EP3-GiについてはCryo-EM SPAにより3.4A分解能で構造決定できた。本年度は、これまで様々なGPCRで試行錯誤していたアレスチンとの複合体形成条件をさらに詳細に検討した。現在までに主に３つの方法でGPCR－アレスチン複合体調製に挑戦している。ひとつはすでに報告されているアレスチンと安定な複合体を形成するGPCRであるV2のC末端ペプチドを人工的にリン酸化したペプチドを合成し、Sortaseを使ってGPCRと酵素反応で融合する方法である。これを用いてGPCR Aではβアレスチン１変異体と安定な複合体を形成できた。これをクライオ電顕でデータ測定し構造解析したが、構造決定に至らなかった。GPCRとアレスチン複合体は様々な状態を形成するためにある程度均一な構造を形成する工夫が必要であることがわかった。その他、ナノディスクに再構成するなどしたが、現在までに構造決定に至っていない。その他、GPCRにV２ペプチドを遺伝子的に融合し、GRKキナーゼでリン酸化したサンプルや野生型をリン酸化したサンプルといった２つの方法を検討したがいずれも安定なGPCR－アレスチン複合体は形成できなかった。
以上のことからリン酸化V２ペプチドをGPCRに融合する方法をさらに発展させて、今後もGPCR－アレスチン複合体の構造解析を目指したい。
|
