研究課題
本研究は、腸管におけるCandida albicansの定着に対する腸内細菌の阻害効果について分子・細胞・個体レベルでの解析を行う。本年度は、マウスにアンピシリン処理を行いC.albicansを経口投与することで、腸管におけるC.albicans腸管定着マウスを作製した。このマウスの腸管各部位において、抗C.albicans抗体を用いC.albicansの形態および定着箇所の詳細を解析した。その結果、腸管に定着したC.albicansは主に酵母型の形態であり、菌糸の存在は確認できなかった。また、C,albicansは腸管内容物中および腸管上皮細胞の近傍にも観察された。次にC.albicansの腸管定着を阻害する細菌の同定を目的として、野生型マウスを様々な抗生物質で処理し、C.albicansを経口投与して腸管定着を観察するとともに、抗生物質処理前後における腸内細菌叢を次世代シークエンサーならびに定量的PCR法を用いて解析した。その結果、b-ラクタム系抗生物質以外の抗生物質で処理しても、C.albicansは腸管に定着できなかった。また、それぞれの抗生物質で処理したマウスでは特徴的な腸内細菌叢を示した。また、ある特定の抗生物質で処理したマウスでは、特定の腸内細菌が腸管に存在することが明らかとなり、この細菌群がC.albicansの腸管定着を阻害する可能性が示唆された。さらに、宿主免疫細胞がC.albicansの腸管定着を阻害する可能性について研究を進めた。まず、好中球や単球を除去する抗Gr-1抗体処理マウスにC.albicansを経口投与したところ、C.albicansは腸管から完全に排除された。その他、様々な免疫細胞を欠損したマウスにC.albicansを経口投与したところ、特定の免疫細胞がC.albicansの腸管定着を阻害する可能性が考えられた。
2: おおむね順調に進展している
本年度は主に1) 腸管におけるCandida albicansの定着部位ならびに形態を明らかにする、2) C. albicansの定着をin vivoにおいて阻害する可能性のある腸内細菌をスクリーニングによって絞り込む、3) C. albicansの腸管定着を阻害する免疫細胞を絞り込む、ことを目的に研究を進めた。その結果、1) 腸管に定着したC.albicansは菌糸を伸ばすことはなく、主に酵母型の形態で存在することを確認した。さらに、C.albicansは腸管内容物だけでなく、腸管上皮細胞の近傍にも観察された。2) 様々な抗生物質処理マウスを用いてスクリーニングした結果、特定の腸内細菌がC.albicansの腸管定着を阻害する可能性が示唆された。3) 様々な免疫細胞の欠損マウスや免疫細胞除去マウスを用いた解析から、特定の免疫細胞がC.albicansの腸管定着を阻害する可能性が示唆された。以上のように、本年度計画していた実験は全て行うことができ、さらに重要な研究成果を得ることができた。これまでに得られた研究成果から、次年度以降の研究計画の立案が可能であり、特に研究内容の変更も必要ないと考えられる。以上のことから、おおむね順調に研究が進行していると考えられた。
本年度にC.albicansの腸管定着を阻害する特定の腸内細菌および免疫細胞の存在が示唆された。今後は、これら特定の腸内細菌および免疫細胞に着目し研究を進める。既に、16S rRNA遺伝子配列を指標として、特定の腸内細菌をマウス腸管から分離、同定している。今後は、in vitroでこれら分離した細菌とC. albicansの共培養実験や、腸内細菌の培養上清を用いてC. albicansの増殖の推移を経時的に観察することで、C. albicansの増殖阻害効果のある腸内細菌を明らかにする。腸内細菌の培養上清中にC. albicansの増殖阻害効果が観察される場合は、培養上清を様々なクロマトグラフィー解析で分離した後に質量分析機を用いてC. albicansの増殖阻害物質の同定を試みる計画である。さらに、C. albicansノトバイオートマウスを作製し、着目している腸内細菌を経口投与することでin vivoにおけるC. albicans腸管定着阻害効果を検証する。C. albicans腸管定着の阻害に関わる宿主免疫細胞の同定も並行して進める。来年度に、特定の免疫細胞サブセットの同定を行う予定である。さらに、腸内細菌によって誘導される免疫細胞が、C. albicansの”colonization resistance”効果に関与する分子メカニズムを明らかにすることを目的に、腸内細菌およびC. albicansによって誘導される免疫細胞の質、量の違いについて、遺伝子発現パターンや抗原特異性などに着目して解析を進める計画である。
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