HCVコア蛋白質のSPPによる切断機構とそのウイルス学的意義の解明

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03479
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 松浦 善治 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (50157252)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: HCV / SPP / MHC

研究実績の概要

これまでに、C型肝炎ウイルス(HCV)のコア蛋白質の成熟に必須な宿主由来のSignal peptide peptidase (SPP)に注目し、SPPで切断されない未成熟なコア蛋白質はE3リガーゼのTRC8によってユビキチン化されて速やかに分解されることを報告している。また、未成熟コア蛋白質の産生が強いERストレスを誘導することから、TRC8による未成熟コア蛋白質の分解は、新規の小胞体品質機構であると考えられた。そこで、未成熟コア蛋白質分解の特異性を検討するために、コア蛋白質に緑色蛍光蛋白質のGFPを融合させ、ゲノムワイドなCRISPRライブラリーを発現するSPP欠損細胞に導入し、コア蛋白質の分解が抑制されていると考えられるGFPの蛍光が強い細胞をフローサイトメトリーによって回収した。得られた細胞からDNAを抽出し、候補遺伝子を検索したところ、遺伝子Aを同定した。遺伝子Aは小胞体ストレスに関与する蛋白質として知られているが、SPPやTRC8と複合体を形成していることを明らかにした。また、遺伝子Aは小胞体ストレスにより活性化されるとリン酸化されることが知られているが、未成熟なコア蛋白質を発現させても、遺伝子Aのリン酸化は確認されなかったことから、遺伝子Aはリン酸化とは異なる活性化を通じて、未成熟コア蛋白質を認識しTRC8と協調して分解に誘導している新しい経路を見出した。その一方で、SPPはコア蛋白質の切断以外にも宿主蛋白質の切断にも関与していることが報告されている。SPPの基質として同定されているすべての蛋白質に関して、SPP欠損細胞に発現させ、コア蛋白質と同様に分解されるかを検討したところ、MHCクラスI分子だけがコア蛋白質と同様にSPP欠損細胞において分解されることを確認した。MHC クラスI分子の分解経路を検討するために、TRC8欠損細胞でのMHC クラスI分子の発現を検討したところ、TRC8はMHC クラスI分子の分解に関与しておらず、別のE3リガーゼが関与していることが考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通りに研究は進み、HCVコア蛋白質はSPPで切断されて成熟化することにより、MHCクラスI分子の成熟化を抑制し、 CD8陽性T細胞の働きを抑制することが示唆された。よって研究は概ね順調に進展していると判断できる。

今後の研究の推進方策

未成熟なコア蛋白質の分解に関与する因子として遺伝子Aを同定することができた。これまでの報告において遺伝子Aは様々な蛋白質と複合体を形成していることから、未成熟なコア蛋白質の分解経路には多くの因子が関与していることが考えられる。したがって、遺伝子A周辺の因子に対して個別にsgRNAを設計し、未成熟コア蛋白質の分解への影響の検討を進め、分解経路に関与する遺伝子群の網羅的同定を目指す。また、今回同定した遺伝子Aの未成熟コア蛋白質を認識機構が不明である。遺伝子Aは小胞体ストレスによって活性化され、リン酸化されることで下流にシグナルを伝えることが知られている。遺伝子A欠損細胞はE3リガーゼのTRC8の存在化でも未成熟コア蛋白質は分解されないため、遺伝子Aは直接的、あるいは間接的に未成熟コア蛋白質の存在をTRC8に伝えることでTRC8による未成熟コア蛋白質の分解が誘導されると考える。この遺伝子AのTRC8への情報伝達経路を検討するため、遺伝子Aの新たな翻訳後修飾を質量分析を駆使して同定を進める。また、MHCクラスI分子が未成熟コア蛋白質と同様にSPP欠損細胞では分解されることを見出した。しかし、未成熟なコア蛋白質はE3リガーゼとしてTRC8依存的に分解されるにも関わらず、未成熟なMHCクラスI分子は、TRC8非依存的であることが分かった。したがって、SPPを阻害することによって生じる未成熟な蛋白質の分解には複数のE3リガーゼが関与していることが考えられたため、未成熟MHCクラスI分子を分解に誘導するE3リガーゼの同定を進める。また、MHCクラスI分子は感染細胞をCD8陽性T細胞に伝えることで感染細胞を除去する機能や、自己・非自己をNK細胞に提示する機能を有する。コア蛋白質の発現によるMHCクラスI分子の発現への影響や、コア蛋白質発現細胞におけるCD8陽性T細胞やNK細胞の活性化への影響を検討し、HCV感染での高率な慢性化の分子機序としての可能性を検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Novel anti-flavivirus drugs targeting the nucleolar distribution of core protein. (2020)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga M, Miyamoto Y, Suzuki T, Otani M, Inuki S, Esaki T, Nagao C, Mizuguchi K, Ohno H, Yoneda Y, Okamoto T, Oka M, and Matsuura Y.
  • 雑誌名: Virology 巻: 541 ページ: 41-51
  • DOI: 10.1016/j.virol.2019.11.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo dynamics of reporter Flaviviridae viruses. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tamura T, garashi M, Enkhbold B, Suzuki T, Okamatsu M, Ono C, Mori H, Izumi T, Sato A, Fauzyah Y, Okamoto T, Sakoda Y, Fukuhara T, and Matsuura Y.
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 93 ページ: 1-15
  • DOI: 10.1128/JVI.01191-19
  • 査読あり
• [雑誌論文] USP15 participates in HCV propagation through the regulation of viral RNA translation and lipid droplet formation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shinji Kusakabe S, Suzuki T, Sugiyama Y, Haga S, Horike K, Tokunaga M, Hirano J, He Z, Chen D. V, Ishiga H, Komoda Y, Ono C, Fukuhara T, Yamamoto M, Ikawa M, Satoh T, Akira S, Tanaka T, Moriishi K, Fukai M, Taketomi A, Yoshio S, Kanto T, Suzuki T, Okamoto T and Matsuura Y.
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 93 ページ: 1708-1718
  • DOI: 10.1128/JVI.01708-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] Roles of secretory glycoproteins in particle formation of Flaviviridae viruses. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fukuhara T, and Matsuura Y.
  • 雑誌名: Microbiol Immunol 巻: 63 ページ: 345-355
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12733
  • 査読あり
• [学会発表] ER stress sensor protein PERK participates in the degradation of immature HCV core protein. (2019)
  • 著者名/発表者名: Junki Hirano, Toru Okamoto, Tatsuya Suzuki, Chikako Ono, Takasuke Fukuhara, and Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: The 38th Annual Meeting of the American Society for Virology (Minnesota, USA).
  • 国際学会
• [学会発表] TLR ligands stimulate in vivo pathogenicity of Japanese encephalitis virus (2019)
  • 著者名/発表者名: Tatsuya Suzuki1, Toru Okamoto1, Yuka Miyata1, Chikako Ono1, Takasuke Fukuhara1, Akatsuki Saito2, Yasuko Orba3, Yuki Eshita3, Hirofumi Sawa3, and Yoshiharu Matsuura1
  • 学会等名: The 38th Annual Meeting of the American Society for Virology (Minnesota, USA).
  • 国際学会
• [学会発表] Involvement of various miRNAs for an efficient replication of HCV (2019)
  • 著者名/発表者名: Chikako Ono, Takasuke Fukuhara, Tomokazu Tamura, Hiroyuki Mori, Asuka Sato, Takuma Izumi, Yuzy Fauzyah, Toru Okamoto, and Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: The 38th Annual Meeting of the American Society for Virology (Minnesota, USA).
  • 国際学会
• [学会発表] Flavivirus NS1 protein plays a crucial role in the infectious particle formation (2019)
  • 著者名/発表者名: Takasuke Fukuhara, Tomokazu Tamura, Shiho Torii, Chikako Ono, Kentaro Kajiwara, Yuhei Morioka, Takuya Yamamoto, Yuzy Fauzyah, Takuma Izumi, Yoshihiro Sakoda, Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: The 18th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会
• [学会発表] Involvement of various miRNAs for an efficient replication of HCV (2019)
  • 著者名/発表者名: Chikako Ono, Takasuke Fukuhara, Tomokazu Tamura, Hiroyuki Mori, Asuka Sato, Takuma Izumi, Yuzy Fauzyah, Toru Okamoto, and Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: The 18th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会
• [学会発表] Characterization of mutation in the 5’UTR of HCV in miR-122-dependent propagation (2019)
  • 著者名/発表者名: Chikako Ono, Takasuke Fukuhara, Yuzy Fauzyah, Shiho Torii, Asuka Sato, Takuma Izumi, Takuya Yamamoto, Yuhei Morioka, and Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: 第67回日本ウイルス学会
• [学会発表] Flavivirus NS1 protein plays a crucial role in the infectious particle formation (2019)
  • 著者名/発表者名: Takasuke Fukuhara, Tomokazu Tamura, Shiho Torii, Chikako Ono, Kentaro Kajiwara, Yuhei Morioka, Takuya Yamamoto, Yuzy Fauzyah, Takuma Izumi, Yoshihiro Sakoda, Yoshiharu Matsuura
  • 学会等名: 第67回日本ウイルス学会
• [学会発表] Ｃ型肝炎対策の残された課題 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松浦善治
  • 学会等名: 第23回日本ワクチン学会学術集会
  • 招待講演