| 研究課題/領域番号 |
19H03512
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
中馬 吉郎 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (40372263)
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| 研究分担者 |
寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
東元 祐一郎 久留米大学, 医学部, 教授 (40352124)
阿部 貴志 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (30390628)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ＤＮＡアプタマー / 抗がん剤 / ホスファターゼ / 核酸医薬 |
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| 研究実績の概要 |
我々は，これまでイオン刺激により特徴的な四重鎖を形成し，特定の標的分子に結合するDNAアプタマー（Ion-Responsive DNA Aptamer, IRDAptamer）を開発し，このIRDAptamerが細胞膜透過能を有することを明らかにしている．そこで，2019年度はIRDAptamerの細胞膜透過に関与するタンパク質の探索，膜透過性IRDAptamerの配列最適化を実施した．これまでにグアニンリッチな塩基配列が細胞膜に存在するヌクレオリンを介して細胞膜に取り込まれることが報告されている．そこで，同様にグアニンを豊富に含むIRDAptamerとヌクレオリンとの細胞内局在について，乳がん由来MCF7細胞を用いた共焦点顕微鏡により詳細に解析した．乳がん原因タンパク質と知られている細胞内脱リン酸化酵素PPM1Dを認識・阻害する IRDAptameの細胞内局在を解析したところ，細胞膜においてヌクレオリンと共局在していることが確認された．このことから，IRDAptamerの細胞膜透過には，ヌクレオリンを介する経路が存在することが示唆された．次に，PPM1D結合IRDAptamerの配列最適化のために，5’および3’末端を欠損した複数のアプタマーを合成し，膜透過性を評価した結果，膜透過性を有するIRDApatmerの最小単位を確定した．また，IRDAptamerのDNA分解酵素，ならびに血清培地中における安定性を評価したところ，四重鎖を形成するIRDAptamerが，直鎖状DNAに比べて極めて安定であることが明らかとなった．これらのことから，IRDAptamerは生体内環境下においても，安定に存在できることが示唆された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度当初計画として，IRDAptamerの細胞膜透過に関与するタンパク質の探索と膜透過性IRDAptamerの配列最適化を計画していた．IRDAptamerの細胞膜透過に関与するタンパク質の探索に関しては，ヌクレオリンが有望な膜透過性に関する有力候補であることを示唆するデータを得ることに成功した．また，膜透過性IRDAptamerの配列最適化に関しては，複数の末端欠損体アナログを合成し，膜透過性に必要な最小構造を確定するとともに，最も効率よく細胞膜透過性を示す配列を同定にした．また，2020年度に計画しているIRDAptamerの細胞内動態評価に先立ち，IRDAptamerの安定性評価を実施し，生体内環境下でもIRDAptamerが極めて安定に存在できることを確認した．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方策として，2019年度の研究成果をもとにがん細胞におけるIRDAptamerの細胞内制御法の確立を目指す．配列最適化したIRDAptemerをがん細胞に投与し, 薬剤の半減期解析，細胞増殖抑制効果, ならびにアポトーシス誘導活性を評価する.チャネル作動薬よる細胞内イオン濃度変化により, PPM1D阻害活性, ならびに細胞増殖抑制効果が制御できることを確認する.また，蛍光標識したIRDAptamerを合成し，細胞内での安定性評価や抗がん活性評価法の確立を目指す．また，マウスを用いたin vivo実験の準備を進め，臨床応用可能なアプタマー創薬としての展開を図る．
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