ALS2分子ネットワーク異常に着眼した上位運動ニューロン変性メカニズムの解明

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03551
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 秦野 伸二 東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
• 研究分担者: 木村 啓志 東海大学, 工学部, 准教授 (40533625) ; 大友 麻子 東海大学, 医学部, 助教 (50535226)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 筋萎縮性側索硬化症 / 運動ニューロン / ALS2 / iPS細胞 / マイクロ流体デバイス

研究実績の概要

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、上位および下位運動ニューロンの選択的変性・脱落を特徴とする神経変性疾患である。近年、下位運動ニューロンの変性メカニズム研究が格段に進展しているなか、上位運動ニューロンに関する研究はほとんど進んでいない。これまで我々は、上位運動ニューロン優位に変性する家族性2型ALSに注目し、その原因遺伝子産物であるALS2分子ネットワーク機能を明らかにしてきた。さらに最近、ヒトiPS細胞から上位運動ニューロンの特徴を有する神経細胞の分化培養法の確立にも成功した。本研究は、これらの研究成果を発展させ、世界初となるヒト上位運動ニューロン変性モデルを作製し、ALS2分子ネットワーク異常を中軸にした細胞機能解析を行うことにより、ALS患者における上位運動ニューロン変性分子メカニズムの解明に挑むものである。本研究計画では、①ヒトiPS細胞の上位運動ニューロンへの分化誘導と長期培養法の確立、②マイクロ流体デバイスを用いたオルガネラ動態の時間空間的解析、③ALS2分子ネットワークを介したオルガネラ動態調節分子メカニズムの解析、の3つの研究テーマについて研究を進めている。研究2年目である令和2年度は、テーマ③についての成果が得られた。具体的には、オルガネラ動態を観察するための新規の蛍光プローブを作製し、細胞内でのオートファゴソームを含む酸性小胞のライブ観察技術の開発に成功した。さらに、ALS発症原因遺伝子でありかつALS2との機能的連関のあるSQSTM1疾患変異体の細胞内動態を明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究計画では、以下の示す3つの研究テーマについての検討を進めている。本研究計画で掲げる3つのテーマについて以下に示す様な進捗状況であり、研究はほぼ順調に進捗している。
テーマ①　ヒトiPS細胞の上位運動ニューロンへの分化誘導と長期培養法の確立：これまでに確立した手法を用いて、健常者、ALS2患者のiPS細胞から上位および下位運動ニューロン様神経細胞へ分化誘導および長期培養を安定的に可能にする条件の最適化を目指している。研究は順調に進捗しており、再現性をもって安定した培養法が確立できている。さらに高度に分化した上位運動ニューロンの同定を可能にする分子マーカーについて探索・検討を進めている。
テーマ②　マイクロ流体デバイスを用いたオルガネラ動態の時間空間的解析：マイクロデバイス上でのヒトiPS細胞由来の運動ニューロン様神経細胞の分化・培養条件（ECMコーティング法、播種、軸索誘因制御）、およびデバイス設計の最適化についての検討を継続している。該当年度は、特に上位運動ニューロンと下位運動ニューロンのコンパートメント共培養を行うための新たなマイクロデバイスの設計・作製・検証を繰り返している。

テーマ③　ALS2分子ネットワークを介したオルガネラ動態調節分子メカニズムの解析：本研究課題では、1) ALS2分子複合体構造と細胞内でのALS2活性化の分子メカニズム解析と、2) ALS2結合分子群によるオルガネラ動態制御メカニズムの解析の2つの課題に取り組んでいる。特に、1）については、マウス脳内でのALS2複合体構造を明らかにし、さらに正常なALS2複合体形成に必須なALS2内の特定領域を同定することにも成功しており（未発表）、観察技術開発と並行して研究は順調に進捗している。

今後の研究の推進方策

本研究は、おおむね順調に進んでおり、研究計画の修正および変更の必要はない。従って、今後も当初の研究計画に従って3つの研究テーマに関する研究を遂行する計画である。
テーマ①　ヒトiPS細胞の上位運動ニューロンへの分化誘導と長期培養法の確立：健常者、ALS2患者のiPS細胞から上位および下位運動ニューロン様神経細胞へ分化誘導する。下位運動ニューロン様神経細胞および上位運動ニューロン様神経細胞の長期培養を安定的に可能にする条件をさらに再現性の高い条件設定を目指し、改良を加える。
テーマ②　マイクロ流体デバイスを用いたオルガネラ動態の時間空間的解析：デバイス上でのヒトiPS細胞由来の運動ニューロン様神経細胞の分化・培養条件（ECMコーティング法、播種、軸索誘因制御）、およびデバイス設計の最適化を図るとともに、異種細胞[（上位運動ニューロン+下位運動ニューロン）、（下位運動ニューロン＋筋細胞）]の共培養法について、独自の方法の確立を目指す。また、画像処理ソフトについては開発を継続する。

テーマ③　ALS2分子ネットワークを介したオルガネラ動態調節分子メカニズムの解析：未だ未解決であるヒト上位運動ニューロン変性分子メカニズムを解明するため、ALS2の分子構造と活性との関連を解析するとともに、ALS2の上流因子と下流因子の全容とその制御系を、主に生化学的ならびに細胞生物学的手法を用いて分子レベルで明らかにする。また、これまでに明らかにされているRab5およびRab17を介するオートファジー・エンドリソソーム系、およびリサイクリング系調節に加え、Rab30、NEK1、およびC21orf2等のALS2結合因子に注目し、ALS2とゴルジ体、一次繊毛、中心体との関連について分子レベルで明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] SQSTM1L341V variant that is linked to sporadic ALS exhibits impaired association with MAP1LC3 in cultured cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Nozaki Masahisa、Otomo Asako、Mitsui Shun、Ono Suzuka、Shirakawa Ryohei、Chen YongPing、Hama Yutaro、Sato Kai、Chen XuePing、Suzuki Toshiyasu、Shang Hui-Fang、Hadano Shinji
  • 雑誌名: eNeurologicalSci 巻: 22 ページ: 100301～100301
  • DOI: 10.1016/j.ensci.2020.100301
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Efficient differentiation and polarization of primary cultured neurons on poly(lactic acid) scaffolds with microgrooved structures (2020)
  • 著者名/発表者名: Otomo Asako、Ueda Mahoko Takahashi、Fujie Toshinori、Hasebe Arihiro、Suematsu Yoshitaka、Okamura Yosuke、Takeoka Shinji、Hadano Shinji、Nakagawa So
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 6716
  • DOI: 10.1038/s41598-020-63537-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Monitoring the autophagy-endolysosomal system using monomeric Keima-fused MAP1LC3B (2020)
  • 著者名/発表者名: Hayashi Hideki、Wang Ting、Tanaka Masayuki、Ogiwara Sanae、Okada Chisa、Ito Masatoshi、Fukunishi Nahoko、Iida Yumi、Nakamura Ayaka、Sasaki Ayumi、Amano Shunji、Yoshida Kazuhiro、Otomo Asako、Ohtsuka Masato、Hadano Shinji
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 ページ: e0234180
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0234180
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Alopecia areata susceptibility variant in MHC region impacts expressions of genes contributing to hair keratinization and is involved in hair loss (2020)
  • 著者名/発表者名: Oka, A., Takagi, A., Komiyama, E., Yoshihara, N., Mano, S., Hosomichi, K., Suzuki, S., Haida, Y., Motosugi, N., Hatanaka, T., Kimura, M., Ueda, M. T., Nakagawa, S., Miura, H., Ohtsuka, M., Tanaka, M., Komiyama, T., Otomo, A., Hadano, S., Mabuchi, T., Beck, S., Inoko, H., and Ikeda, S.
  • 雑誌名: EBioMedicine 巻: 57 ページ: 102810～102810
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2020.102810
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 筋萎縮性側索硬化症（ALS）細胞モデルの構築を目指した骨格筋及下位運動ニューロン培養法の確立 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内藤佳津子、加納葵、藤田紘暉、大友麻子、木村啓志、秦野伸二
  • 学会等名: 東海大学マイクロ・ナノ啓発会【Tμne】第13回学術講演会
• [学会発表] マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部モデルの確立 (2021)
  • 著者名/発表者名: 加納葵、藤田紘暉、大友麻子、秦野伸二、木村啓志
  • 学会等名: 東海大学マイクロ・ナノ啓発会【Tμne】第13回学術講演会
• [学会発表] Altered oligomeric states in pathogenic ALS2 variants associated with juvenile motor neuron diseases cause loss of ALS2-mediated endosomal function. (2020)
  • 著者名/発表者名: Sato, K., Otomo, A., Ueda, M. T., Hiratsuka, Y., Suzuki-Utsunomiya, K., Sugiyama, J., Murakoshi, S., Mitsui, S., Ono, S., Nakagawa, S., Shang, H. -F., and Hadano, S.
  • 学会等名: Experimental Biology 2020/2020 ASBMB Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] SQSTM1の欠損は神経細胞と末梢組織細胞のユビキチン化タンパク質動態に異なった影響をもたらす (2020)
  • 著者名/発表者名: 三井駿、石山政仁、島倉健人、佐藤海、小野鈴花、大友麻子、石井哲郎、柳川徹、青木正志、秦野伸二
  • 学会等名: 第43回日本神経科学大会
• [学会発表] 神経終末画分におけるALS2は細胞質画分とは異なる特異的高次構造を形成する (2020)
  • 著者名/発表者名: 佐藤海、鈴木-宇都宮恭子、三井駿、小野鈴花、島倉健人、大友麻子、秦野伸二
  • 学会等名: 第43回日本神経科学大会
• [学会発表] 細胞内膜小胞トラフィッキング異常に焦点を当てた神経変性疾患新規薬剤スクリーニング系の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 秦野伸二
  • 学会等名: 東海大学卓越研究員制度シンポジウム
  • 招待講演
• [備考] 分子神経病態科学研究室
  • URL: http://mls.med.u-tokai.ac.jp/hadano/