ステルス型RNAベクターを用いた遺伝性造血系疾患に対する新規遺伝子治療法の開発

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03613
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 高田 英俊 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70294931)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 遺伝子治療 / ステルス型RNAウイルスベクター / 重症複合免疫不全症

研究実績の概要

ステルス型RNAベクター（SRV）を用いて造血幹細胞／前駆細胞をターゲットとして、遺伝子治療開発研究を行った。マウス骨髄からLineage-細胞をマイクロビーズを用いて純化し、セルソーターでlineage-c-kit+sca-1+細胞を分離することで、マウス造血幹細胞／造血前駆細胞を得た。この細胞に対してSRVを用いて遺伝子導入したところ、MOI3～4でGFP陽性率30%前後と、極めて良好な遺伝子導入効率が得られることを確認した。Methocult m3434を用いてコロニーアッセイを行ったところ、顆粒球系コロニーが観察された。遺伝子導入したマウス造血幹細胞／前駆細胞を放射線照射したNOGマウスに静脈内投与し、血球の分化増殖を期待しているが、現時点では不十分な結果しか得られていない。遺伝子導入後の細胞の分化・増殖が安定していない可能性があると考えている。SRVベクターは遺伝子発現量が極めて高いため、細胞の安定性に問題が生じている可能性があり、現在、ベクターを調整中である。
ヒト臍帯血からマイクロビーズで純化し、SRVを感染させたところ、MOI10で、GFP陽性率90%と極めて高い遺伝子導入効率が確認された。この細胞を用いたコロニーアッセイでも、造血系細胞のコロニー産生が確認できた。長期的にin vitroで培養すると、マウスの細胞よりもヒト臍帯血造血幹細胞／前駆細胞が遺伝子導入後の細胞機能の安定性が高いことが確認できた。
東北大学免疫学の教室石井直人教授よりヒト由来共通γ鎖欠損株であるED40515細胞を供与いただき、この細胞に共通γ鎖をSRVを用いて遺伝子導入したところ、IL-2刺激によりSTAT5のリン酸化がWestern blotで確認することができ、受容体からのシグナル伝達が正常におこることを確認することができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究協力者である産業技術総合研究所／ときわバイオの中西真人先生や筑波大学蛍光バイオイメージング研究室の三輪佳宏先生とは、定期的に研究内容についての会議を開催している。若干ウイルスの調整に時間を要したが、マウスの手配や、ヒト臍帯血の提供先など順調に研究推進に向けた基盤が構築できた。実際にマウスの造血幹細胞の純化や、実際の遺伝子導入、NOGマウスのirradiation、NOGマウスへの遺伝子導入細胞の投与などは順調に行う事ができた。In vitro解析としてコロニーアッセイを繰り返し行っているが、まだ若干、結果が不安定なところがある。この点については、遺伝子発現レベルが高すぎるベクターを用いると、細胞増殖の安定性が見られない事がわかってきた。
幸いな事に、ヒト由来の共通γ鎖を欠損したCell lineを東北大学免疫学教室の石井直人教授から供与していただくことができ、遺伝子導入による蛋白の機能解析を進めることができた。
研究で用いる大型機器は、ほとんど筑波大学内のオープンファシリティーシステムにあるため、研究が順調に進行した。マウスを用いた実験は、研究環境の整備された筑波大学内の動物資源センターで順調に進めることができた。

今後の研究の推進方策

遺伝子治療研究で重要な点は、ベクターの機能性であり、遺伝子導入効率や遺伝子導入後の細胞機能の安定性・再現性である。それに向けて、ベクターも最善の形へと適宜改変されるべきである。これまでの研究によりマウスの造血幹細胞／造血前駆細胞と比較して、ヒトのCD34陽性細胞のほうが、より遺伝子導入効率が良く、細胞の安定性も高いことがわかってきた。この結果を踏まえ、研究協力者と協議し、in vitroおよびin vivoの遺伝子導入効果を繰り返し観察するとともに、さらに安定した遺伝子導入が得られるようなベクターの改変も行う事にした。
今後、in vivoのデータを充実させ、NOGマウスにおける細胞分化を観察したデータを出すことを中心として研究を進めたいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Novel ARX Mutation Identified in Infantile Spasm Syndrome Patient (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeshita Y, Ohto T, Enokizono T, Tanaka M, Suzuki H, Fukushima H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: 7 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0094-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitative Assessment of Fine Motor Skills in Children Using Magnetic Sensors (2020)
  • 著者名/発表者名: Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Maruo K, Sano Y, Kandori A, Takada H
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.03.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Outcomes of Paediatric Out-Of-Hospital Cardiac Arrest According to Hospital Characteristic Defined by the Annual Number of Paediatric Patients With Invasive Mechanical Ventilation: A Nationwide Study in Japa (2020)
  • 著者名/発表者名: Kido T, Iwagami M, Yasunaga H, Abe T, Enomoto Y, Matsui H, Fushimi K, Takada H, Tamiya N
  • 雑誌名: Resuscitation 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.resuscitation.2019.12.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] Urgent Proton Beam Therapy With Interinstitutional Transfer for Patients With Intracranial Rhabdomyosarcoma: Report of 3 Cases (2020)
  • 著者名/発表者名: Inaba M, Nakao T, Hosaka S, Suzuki R, Fukushima H, Yamaki Y, Saito T, Sakashita S, Noguchi M, Minami M, Masumoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001620
  • 査読あり
• [雑誌論文] Patient Transfer to Receive Proton Beam Therapy During Intensive Multimodal Therapy Is Safe and Feasible for Patients With Newly Diagnosed High-risk Neuroblastoma (2020)
  • 著者名/発表者名: Hosaka S, Fukushima H, Nakao T, Suzuki R, Yamaki Y, TanakaK, Saito T, Mizumoto M, Sakurai H, Takashi Fukushima T, Takada H
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001570
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Case of Autism Spectrum Disorder With Cleft Lip and Palate Carrying a Mutation in Exon 8 of AUTS2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Saeki S, Enokizono T, Imagawa K, Fukushima H, Kajikawa D, Sakai A, Tanaka M, Ohto T, Suzuki H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • 雑誌名: Clin Case Rep 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1002/ccr3.2377
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lipidomics Links Oxidized Phosphatidylcholines and Coronary Arteritis in Kawasaki Disease (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakashima Y, Sakai Y, Mizuno Y, Furuno K, Hirono K, Takatsuki S, Suzuki H, Onouchi Y, Kobayashi T, Tanabe K, Hamase K, Miyamoto T, Aoyagi R, Arita M, Yamamura K, Tanaka T, Nishio H, Takada H, Shouichi Ohga S, Hara T
  • 雑誌名: Cardiovasc Res 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1093/cvr/cvz305
  • 査読あり
• [雑誌論文] Decision-making Dilemmas of Paediatricians: A Qualitative Study in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Sasazuki M, Yasunari Sakai Y, Kira R, Toda N, Ichimiya Y, Akamine S, Torio M, Ishizaki Y, Sanefuji M, Narama M, Itai K, Hara T, Takada H, Kizawa Y, Ohga S
  • 雑誌名: BMJ Open . 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1136/bmjopen-2018-026579
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neonatal Outcomes of Very Low Birthweight Infants Born to Mothers With Hyperglycaemia in Pregnancy: A Retrospective Cohort Study in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Hitaka D, Morisaki N, Miyazono Y, Piedvache A, Nagafuji M, Takeuchi S, Kajikawa D, Kanai Y, Saito M, Takada H
  • 雑誌名: BMJ Paediatr Open 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1136/bmjpo-2019-000491
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Novel Missense PTEN Mutation Identified in a Patient With Macrocephaly and Developmental Delay (2019)
  • 著者名/発表者名: Y, Enokizono T, Fukushima H, Ohto T, Imagawa K, Tanaka M, Sakai A, Suzuki H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41439-019-0056-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] MOB1 Regulates Thymocyte Egress and T-cell Survival in Mice in a YAP1-independent Manner (2019)
  • 著者名/発表者名: Kato W, Nishio M, To Y, Togashi H, Mak TW, Takada H, Ohga S, Maehama T, Suzuki A
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 24 ページ: 485-495
  • DOI: 10.1111/gtc.12704
  • 査読あり
• [雑誌論文] Plasma Concentration of Tamoxifen and Its Metabolites in a Neonate and Mother Receiving Tamoxifen: A Case Report of a Pregnant Woman (2019)
  • 著者名/発表者名: Konishi K, Miyazono Y, Doki K, Kido T, HitakaD, Kanai Y, Takada H, Homma M
  • 雑誌名: Ther Drug Monit 巻: 41 ページ: 405-406
  • DOI: 10.1097/FTD.0000000000000608
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of Immunity Against Epstein-Barr Virus Infection in a Patient With CHARGE/complete DiGeorge Syndrome After Peripheral Blood Lymphocyte Transfusion (2019)
  • 著者名/発表者名: Hosaka S, Chie Kobayashi C, Saito H, Imai-Saito A, Suzuki R, Iwabuchi A, Kato Y, Jimbo T, Watanabe N, Onodera M, Imadome K, Masumoto K, Nanmoku T, Fukushima T, Kosaki K, Sumazaki R, Takada H
  • 雑誌名: Pediatr Transplant 巻: 23 ページ: -
  • DOI: 10.1111/petr.13424. Epub 2019 Apr 29
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epstein-Barr Virus-Associated γδ T-Cell Lymphoproliferative Disorder Associated With Hypomorphic IL2RG Mutation (2019)
  • 著者名/発表者名: 9.Tanita, K., Hoshino, A., Imadome, K. I., Kamiya, T., Inoue, K., Okano, T., Yeh, T. W., Yanagimachi, M., Shiraishi, A., Ishimura, M., Schober, T., Rohlfs, M., Takagi, M., Imai, K., Takada, H., Ohga, S., Klein, C., Morio, T., & Kanegane, H
  • 雑誌名: Front Pediatr 巻: 4 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fped.2019.00015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Procalcitonin Levels Predicting the Infliximab Response of Immunoglobulin Resistant Kawasaki Disease (2019)
  • 著者名/発表者名: 10.Nakashima, Y., Nanishi, E., Yamamura, K., Uike, K., Terashi, E., Hirata, Y., Nagata, H., Morihana, E., Tanaka, T., Honjo, S., Takada, H., & Ohga, S. (2019). Procalcitonin levels predicting the infliximab response of immunoglobulin resistant Kawasaki disease.
  • 雑誌名: Cytokine 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.cyto.2018.11.025
  • 査読あり
• [雑誌論文] Early canakinumab therapy for the sensorineural deafness in a family with Muckle-Wells syndrome due to a novel mutation of NLRP3 gene (2019)
  • 著者名/発表者名: 11.Iida, Y., Wakiguchi, H., Okazaki, F., Nakamura, T., Yasudo, H., Kubo, M., Sugahara, K., Yamashita, H., Suehiro, Y., Okayama, N., Hashimoto, K., Iwamoto, N., Kawakami, A., Aoki, Y., Takada, H., Ohga, S., & Hasegawa, S
  • 雑誌名: Clinical rheumatology 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s10067-018-4331-8
  • 査読あり
• [学会発表] 緊急対応を要する原発性免疫不全症 診断への最短コースと初期対応 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高田英俊
  • 学会等名: 第122回日本小児科学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 予防接種と免疫不全 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高田英俊
  • 学会等名: 第657回日本小児科学会東京地方会