ステルス型RNAベクターを用いた遺伝性造血系疾患に対する新規遺伝子治療法の開発

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03613
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 高田 英俊 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70294931)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 遺伝子治療 / ステルス型RNAウイルスベクター / 重症複合免疫不全症

研究実績の概要

ステルス型RNAベクター（SRV）を用いてヒトおよびマウスの造血幹細胞／前駆細胞，即ち，ヒト臍帯血CD34陽性細胞およびマウスのlineage-c-kit+sca-1+細胞をターゲットとして、遺伝子治療開発研究を継続している。いずれも高い遺伝子導入効率が得られることを再確認し，Methocult m3434を用いたコロニーアッセイの結果，遺伝子を導入した造血系前駆細胞は増殖能および分化能を有していることが確認できた。特に，ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞では、MOI 10で、GFP陽性率90%と極めて高い遺伝子導入効率が確認された。長期的にin vitroで培養すると、マウスの細胞よりもヒト臍帯血造血幹細胞／前駆細胞が遺伝子導入後の細胞機能の安定性が高いことが確認できた。また，ヒト由来共通γ鎖欠損ED40515細胞に共通γ鎖をSRVを用いて遺伝子導入したところ、IL-2刺激によりSTAT5のリン酸化が確認することができ、受容体からのシグナル伝達が正常におこることを確認できた。他方，遺伝子を導入した細胞を長期的に培養すると，導入した遺伝子の発現を維持する事が難しい場合があるという事がわかり，以前用いていたベクターとは異なる結果となった。遺伝子導入したマウス造血幹細胞／前駆細胞を放射線照射したNOGマウスに静脈内投与した結果では，現時点では不十分血球増殖しか得られていない。遺伝子導入した細胞のRNA Seq解析を行ったところ，遺伝子非導入細胞と比較すると，若干細胞増殖や細胞死に関連する遺伝子発現に差が見られ，遺伝子導入後の細胞の分化・増殖が安定していない可能性がある。SRVベクターは遺伝子発現量が極めて高い事やベクターに搭載している蛍光遺伝子に問題がある可能性があり，これらの点を改良したベクターで研究を継続する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

マウスの造血幹細胞の純化や、実際の遺伝子導入、NOGマウスのirradiation、NOGマウスへの遺伝子導入細胞の投与などは順調に行う事ができ，特にヒトCD34陽性細胞では安定した遺伝子導入が可能である事がわかってきた。共通γ鎖欠損細胞に遺伝子導入することによって機能が回復することも確認できた。遺伝子導入後の細胞の変化についてRNA Seqによる検討を行ったところ，若干細胞増殖や細胞死関連の遺伝子発現に影響が見られ，遺伝子導入後の細胞の安定性を得るためにもベクターのさらなる改良を行う事にした。このように，ベクターの特徴や遺伝子導入後の細胞の変化などについて詳細な解析ができていると考えている。研究で用いる大型機器は、ほとんど筑波大学内のオープンファシリティーシステムにあるため、研究が順調に進行している。マウスを用いた実験は、研究環境の整備された筑波大学内の動物資源センターで順調に進めることができた。研究協力者である産業技術総合研究所／ときわバイオの中西真人先生や筑波大学蛍光バイオイメージング研究室の三輪佳宏先生とは、定期的に研究内容についての会議を開催している。

今後の研究の推進方策

現在のベクターを用いて，遺伝子修復への橋渡しを行うことも可能であると考えられる。特に，放射線感受性の高い重症複合免疫不全症患者の造血系細胞は増殖が不安定であり，このベクターを用いて細胞増殖を安定化し，遺伝子修復につなげることが可能であると考え実際に研究に着手している。ベクター自体のさらなる改良も平行して行っており，近く完成予定である。今後は，新たなベクターを用いて，遺伝子導入を行い，遺伝子導入した造血系前駆細胞を用いた研究を行っていく方針である。

研究成果

• [雑誌論文] A Case of omalizumab-associated eosinophilic granulomatosis with polyangiitis. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamaki Y, Hayashi D, Honda K, Imai H, Takada H.
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Severe adenovirus type F enteritis in a young child with acute myeloid leukemia. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki-Suda A, Fukushima H, Suzuki R, Yamaki Y, Takada H
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: in press
  • DOI: 10.1111/ped.14461
  • 査読あり
• [雑誌論文] Short-term intensive gastrointestinal endoscopy training program. (2021)
  • 著者名/発表者名: Morita A, Kudo T, Horiuchi A, Kajiyama M, Tanaka N, Takada H.
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: in press
  • DOI: 10.1111/ped.14721
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pneumococcal serotype-specific opsonophagocytic activity in interleukin-1 receptor-associated kinase 4-deficient patients. (2021)
  • 著者名/発表者名: Uehara T, Morino S, Oishi K, Nakamura Y, Togashi N, Imaizumi M, Nishimura S, Okada S, Yara A, Fukushima H, Imagawa K, Takada H.
  • 雑誌名: Pediatr Infect Dis J 巻: 40 ページ: 460-463
  • DOI: 10.1097/INF.0000000000003060
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effectiveness of water jelly ingestion for both rehabilitation and prevention of aspiration pneumonia in elderly patients with moderate to severe dysphagia. (2021)
  • 著者名/発表者名: Morita A, Horiuchi A, Horiuchi I, Takada H.
  • 雑誌名: J Clin Gastroenterol 巻: 2021 Jan 19
  • DOI: 10.1097/MCG.0000000000001493
  • 査読あり
• [雑誌論文] Utilization of a novel Sendai virus vector in ex vivo gene therapy for hemophilia A. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamaki Y, Fukushima T, Yoshida N, Nishimura K, Fukuda A, Hisatake K, Aso M, Sakasai T, Kijima-Tanaka J, Miwa Y, Nakanishi M, Sumazaki R, Takada H
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 113 ページ: 493-499
  • DOI: 10.1007/s12185-020-03059-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of fetal-onset type 3 familial hemophagocytic lymphohistiocytosis surviving without severe complications after early diagnosis and treatment. (2021)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto T, Fukushima H, Fujiyama S, Nagatomo K, Hosaka S, Suzuki R, Yamaki Y, Kanai Y, Shibata H, Yasumi T, Isshiki K, Kato M, Miyazono Y, Takada H.
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer 巻: Mar 26:e29016. ページ: 1-4
  • DOI: 10.1002/pbc.29016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detailed analysis of Japanese patients with adenosine deaminase 2 deficiency reveals characteristic elevation of type II interferon signature and STAT1 hyperactivation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nihira H, Izawa K, Ito M, Umebayashi H, Okano T, Kajikawa S, Nanishi E, Keino D, Murakami K, Isa-Nishitani M, Shiba T, Honda Y, Hijikata A, Yasu T, Kubota T, Hasegawa Y, Kawashima Y, Nakano N, Takada H, et al.
  • 雑誌名: J Allergy Clin Immunol 巻: S0091-6749(21) ページ: 00157-3
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2021.01.018
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cognitive functions of pediatric brain tumor survivors treated with proton beam therapy: A case series. (2021)
  • 著者名/発表者名: Hidaka K, Fukushima H, Hosaka S, Muroi A, Yamamoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Takada H
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 43 ページ: 475-481
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000002011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel ACOX1 mutations in two siblings with peroxisomal acyl-CoA oxidase deficiency. (2021)
  • 著者名/発表者名: Morita A, Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Watanabe S, Takada Y, Iwama K, Mizuguchi T, Matsumoto N, Morita M, Takashima S, Shimozawa N, Takada H.
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: S0387-7604(20) ページ: 30291-6
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.10.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] IRAK4 deficiency presenting with anti-NMDAR encephalitis and HHV6 reactivation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishimura S, Kobayashi Y, Ohnishi H, Moriya K, Tsumura M, Sakata S, Mizoguchi Y, Takada H, Kato Z, Sancho-Shimizu V, Picard C, Irani SR, Ohara O, Casanova JL, Puel A, Ishikawa N, Okada S, Kobayashi Masao.
  • 雑誌名: J Clin Immunol 巻: 41 ページ: 125-135
  • DOI: 10.1007/s10875-020-00885-5
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Nationwide survey of late-onset hemolysis in very low birth weight infants. (2021)
  • 著者名/発表者名: Miyazono Y, Arai J, Kanai Y, Hitaka D, Kajikawa D, Takeuchi S, Nagafuji M, Fujiyama S, Saito M, Takada H.
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: 63 ページ: 172-176
  • DOI: 10.1111/ped.14493
  • 査読あり
• [雑誌論文] Poststreptococcal acute glomerulonephritis in a girl with renal cell carcinoma: possible pathophysiological association. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kageyama A, Fukushima H, Usui J, Iwabuchi A, Suzuki R, Masumoto K, Oda T, Nagata M, Takada H.
  • 雑誌名: CEN Case Rep 巻: Feb;10(1) ページ: 139-144
  • DOI: 10.1007/s13730-020-00526-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A case of cardiac tamponade without cardiac tumor in pediatric lymphoma. (2020)
  • 著者名/発表者名: Okuwaki H, Kido T, Enomoto Y, Suzuki R, Takada H
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: 62 ページ: 1201-1202
  • DOI: 10.1111/ped.14280.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A follow-up report of an infant born to a mother receiving tamoxifen. (2020)
  • 著者名/発表者名: Okada Y, Hitaka D, Kido T, Kanai Y, Konishi K, Doki K, Katayama N, Homma M, Miyazono Y, Takada H.
  • 雑誌名: Case Rep Pediatr 巻: Jul 26 ページ: 2020:2056756
  • DOI: 10.1155/2020/2056756
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Quantitative assessment of fine motor skills in children using magnetic sensors. (2020)
  • 著者名/発表者名: Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Maruo K, Sano Y, Kandori A, Takada H
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: 42 ページ: 421-430
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.03.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] A family with Gitelman syndrome with asymptomatic phenotypes while carrying reported SLC12A3 mutations. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa M, Tada Y, Tanaka H, Morii W, Inaba M, Takada H, Mori T, Noguchi E
  • 雑誌名: Case Rep Nephrol Dial 巻: 10 ページ: 71-78
  • DOI: 10.1159/000507845
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Successful trans-maternal nadolol pharmacotherapy in a fetus presenting with long QT syndrome type 2 complicated by torsade de pointes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shima Y, Horigome H, Nozaki Y, Lin L, Ishiodori T, Yano Y, Takahashi M, Murakami T, Yamasaki H, Taskada H.
  • 雑誌名: J Cardiol Cases 巻: 22 ページ: 265-268
  • DOI: 10.1016/j.jccase.2020.07.006
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel ARX mutation identified in infantile spasm syndrome patient. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeshita Y, Ohto T, Enokizono T, Tanaka M, Suzuki H, Fukushima H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H.
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: 7:9 ページ: 1-3
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0094-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Outcomes of paediatric out-of-hospital cardiac arrest according to hospital characteristic defined by the annual number of paediatric patients with invasive mechanical ventilation: A nationwide study in Japan. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kido T, Iwagami M, Yasunaga H, Abe T, Enomoto Y, Matsui H, Fushimi K, Takada H, Tamiya N.
  • 雑誌名: Resuscitation 巻: 148 ページ: 49-56.
  • DOI: 10.1016/j.resuscitation.2019.12.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] Patient transfer to receive proton beam therapy during intensive multimodal therapy is safe and feasible for patients with newly diagnosed high-risk neuroblastoma. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hosaka S, Fukushima H, Nakao T, Suzuki R, Yamaki Y, Tanaka K, Saito, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 42 ページ: e18-e24
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001570
  • 査読あり
• [雑誌論文] Urgent proton beam therapy with interinstitutional transfer for patients with intracranial rhabdomyosarcoma: Report of 3 Cases. (2020)
  • 著者名/発表者名: Inaba M, Nakao T, Hosaka S, Suzuki R, Fukushima H, Yamaki Y, Saito T, Sakashita S, Noguchi M, Minami M, Masumoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H.
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 42 ページ: e12-e17
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001620
  • 査読あり
• [学会発表] 原発性免疫不全症の病態と治療の展開 (2021)
  • 著者名/発表者名: 高田英俊
  • 学会等名: 日本免疫不全・自己炎症学会
  • 招待講演
• [学会発表] Hematopoietic stem cell transplantation for inborn errors of immunity in Japan: overview of a nationwide retrospective analysis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto S, Yanagimachi M, Umeda K, Iguchi A, Sasahara Y, Takada H, et al.
  • 学会等名: 46th European Society for Blood and Marrow Transplantation
  • 国際学会
• [学会発表] Congenital biliary dilatation in an infant with citrin deficiency. (2020)
  • 著者名/発表者名: Morita A, Imagawa K, Tagawa M, Takada H
  • 学会等名: The 6th World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition
  • 国際学会
• [図書] 小児感染免疫学 (2020)
  • 著者名/発表者名: 高田英俊
  • 総ページ数: 780
  • 出版者: 朝倉書店