| 研究課題/領域番号 |
19H03625
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| 研究機関 | 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所) |
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研究代表者 |
上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 所長 (90262708)
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| 研究分担者 |
大平 美紀 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (20311384)
堺 隆一 北里大学, 医学部, 教授 (40215603)
牛島 俊和 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (90232818)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | iPS / 神経芽腫 / MYCN / エピゲノム / ポリコーム |
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| 研究実績の概要 |
これまでにMYCN導入iPS/NCC形質転換クローンのトランスクリプトーム解析を行い、MYCN導入時に、MYCNによる複製ストレスによると想定される分化誘導およびがん遺伝子ストレスによる老化経路の亢進が判明した。これらの細胞を軟寒天培地による形質転換を行うと、興味深いことにポリコームによるヒストン修飾・DNAメチル化・テロメア維持経路が亢進した。これらの結果を受けてH3K27Ace, H3K4me3解析に加えてH3K27me1, H3K27me2, H3K27me3、H2K119ub解析を行った。
MYCN導入NCCはCDMi + SB + CHIR培養法によるcranial type NCCであった。ここから軟寒天培地による形質転換を行って、免疫不全マウスに移植すると、Chondroblastic osteosarcomaの病理学特徴が認められた腫瘍を複数クローンで形成した。骨肉腫モデルと考えられるフェノタイプであった（論文作成中）。そこでBMP activator or BMP/ FGF2/CHIRで培養してtrunk type NCCの培養法を確立し、ここにMYCNを導入して神経芽腫モデル構築を検討した。
神経芽腫におけるPRC2の構成分子EZH2の機能解析を行い、MYCNの下流で神経芽腫における分化抑制を行い、そのエフェクターとしてTrkAがあることを報告した（ONCOGENE, 2018）．また神経芽腫におけるポリコームPRC1の機能解析としてRING1A/1Bのノックダウン解析を行い、神経芽腫におけるH2AK119ub活性の主体となる酵素がRING１Aであることを明らかにした（Dokkyo Journal of Medical Sciences, 2020）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
神経芽腫においてH3K27Ace, H3K4me3, EZH2, H3K27me3解析をChIPseq法で行った。特にEZH2 and/or H3K27me3のゲノム部位をヒートマップ解析し、EZH2/ H3K27me3の共存するがん抑制遺伝子群とEZH2単独が存在する遺伝子群を同定して、神経芽腫におけるCanonical PRC2作用とEZH2単独の作用による癌抑制遺伝子抑制の存在を見出した。これらの結果から、EZH２阻害剤の神経芽腫に対する作用と分子機序を検討した。EZH2阻害剤感受性株においては細胞増殖に抑制がみられ、G0/G1 cell cycle arrest、アポトーシスが見られた。一方で耐性株では増殖抑制を認めなかった。Transcriptome解析、GSEA解析では感受性株にのみ、分化や細胞周期停止に有意な相関を認めた。感受性株のみ有意にmRNAレベルでの発現上昇を認めた遺伝子のうち、さらに神経芽腫のデータベースより癌抑制的に働くとされる遺伝子を選択した。それらのEZH2阻害剤により発現増加した多くの遺伝子は、感受性株においてプロモーター領域にH3K27me3のPeakを有したが、一方で耐性株の一部の遺伝子ではプロモーター領域のCpGアイランドにメチル化を認めた。EZH2阻害剤 (EPZ-6438)とDNMT阻害剤 (5-aza-dC)を併用したところ、EZH2耐性株に対する増殖抑制に相乗効果を認めた。併用処理を行った耐性株を使用し、トランスクリプトーム、メチローム解析を行ったところ、癌抑制遺伝子、癌遺伝子におけるエピジェネティックな変化を認めた。さらにVSTM2L、GPNMB、TIMP3のプロモーター領域におけるCpGアイランドのメチル化が予後不良な神経芽腫患者のEZH2阻害剤耐性のバイオマーカーとな得ることを見出した（投稿準備中）。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は臨床検体でのヒストンコード解析を可能にするために、Cut＆TagおよびCut＆Run解析の方法を今年度確立する。前年度得られたChIPseq法によるH3K27Ace, H3K4me3, EZH2, H3K27me3解析結果との相関によって妥当性を検証する。またこれまで行ってきたMYCN ChIPseq解析とCut＆TagおよびCut＆Run解析の結果を比較する。
BMP activator or BMP/ FGF2/CHIRで培養してtrunk type NCCの培養法を確立した。これらの細胞のマーカーはSOX10: NCCマーカー＋/PHOX2B:T-NCCマーカー＋/HOXC9:T-NCCマーカー＋が発現することを確認した。今年度は、p53変異trunk type NCCの培養を同様の培養で行い、フェノタイプを確認する。このp53変異trunk type NCC にMYCNを導入して難治性神経芽腫モデル構築を検討する。またp53変異trunk type NCCにてATRXのCrisper-Cas9 KOを行い、形質転換したクローンでALTが起きるかをスクリーニングする。
Li-Fraumeni (Li-F) 症候群 iPS 細胞由来の頭部神経堤細胞 (cNCC) からSingle guide RNA によるATRX欠損株 (Li-F ATRX KO cNCC) を 作製し、限界希釈法を用いたLi-F ATRX KO cNCCクローンかを行なった。そのクローンにおいてC-circle陽性細胞を得ることができた。
ALT陽性クローンについてNGSを施行し、NBにおけるALT機構の原因遺伝子を検索する。また、野生型trunk type NCCにMYCNとwt ALK, ALK F1147L, ALK R1275Qを導入して神経芽腫モデル構築を検討する。
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