| 研究課題/領域番号 |
19H03659
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
斎藤 能彦 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30250260)
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| 研究分担者 |
尾上 健児 奈良県立医科大学, 医学部, 学内講師 (90510173)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 心不全 / アフターロードミスマッチ / sFlt-1 / β受容体脱感作 / GRK2 / Βarrestin 2 |
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| 研究実績の概要 |
急性心不全の発症病態の１つとして急性の後負荷に対する不適合(afterload mismatch)が以前より広く認められているが、その分子機序は明らかではない。また、急性心不全の75％は慢性腎臓病(CKD)を合併しており、CKD合併心不全において一番多い急性心不全の病態はafterload mismatchである。申請者らは、独自に開発したCKDモデルマウスに後負荷刺激した時に、特異的に発現低下するLong non-cording RNA を発見し、このLncRNA Xは、MEKに結合してMEK活性を抑制することからMKE inhibiting RNA(MEKiR)と命名した。このMEKiRの低下がafterload mismatchに関与している予備実験結果を得ている。また、急性心不全の原因の一つである、タコツボ型心筋症の発症にβアドレナリン受容体（βADR）の活性化とそれに引き続いて生じるβADRの脱感作が関与していることを世界で初めて提唱した。
本プロジェクトでは、１）交感神経系の脱感作がafterload mismatchの発症に関与しているかをGRK2やβarrestinを心臓あるいは血管に高発現させて検討している。2) MEKiRの人ホモローグの同定と調整機序の解析、実施する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MEKiRがヒトホモローグを探索する前に、まずMEKiRが圧負荷時に発現減少する機序を解析した。その結果、圧負荷時にP53が活性化することはよく知られているが、その結果P53の活性化の後に、E2Fのリクルートメントの抑制を介して、MEKiRの発現が低下していることが示された。
現在、ヒトホモローグの探索にあたって、ヒトMEKをベイトにして、MEKに結合するLong RNAスクリーニングする予定である。この方法の妥当性を確認する為に、まず、マウスMEKをベイトにしてマウス線維芽細胞にMEKを強制発現して、MEKに結合するRNAを探索したところ、予定通りMEKiRが同定された。従って、現在、ヒト線維芽細胞にヒトMEKを２種類のタグ付きで強制発現し、結合されるRNAを回収し、異なるタグで2回精製を繰り返し、回収された、RNAをRNAsecに回し解析中である。これらの予備実験に時間がかかった。
βアドレナリン脱感作の実験では、GRK2とβarrestin2とAAVに結合し血管での脱感作実験を予定していたが、in vivoでのマウスにいかに効率よくAAVを投与するか？また、血管に特に高発現するAAVの種類を検討するのに時間を要した。
しかし、結局はマウスの腹腔内投与で十分であること、また、AAV-DJ8が血管に高発現することが分かり、AAV-DJ8にGRK2とβarrestin2を結合したAAVの作成し完成した。予備実験に時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) MEKiRのヒトホモローグの探索
昨年までの継続であるが、ヒトMEKをベイトにして、MEKに結合してきたRNAをMEKに結合してある２種類のタグを用いたaffinity精製を試みRNA secで候補RNAを探索する。
2)β受容体の血管での脱感作がCS１の機序として機能しているかの検討では、AAV-GRK2-DJ8をマウスに腹腔内投与し、その3日後にエピネフリンを投与して後負荷を加える。最近では、漸くこの系が機能し始め、現在エピネフリン刺激によりコントロールのAAV-DJ8ベクターを投与したマウスより、AAV-GRK2-DJ8を投与したマウスの方が、血圧の上昇が有意に大きいことを確認できた。直後の解剖初見で肺重量の増加を認めている。今後、大動脈の平滑筋細胞を免疫染色で検討し、βarrestinやGRK2の細胞膜への移行とPKA顆粒のCREBのリン酸化の低下を確認する。また、AAV-GRK2-DJ8を投与後の心機能も検討する。
sFlt-1 KO（心腎連関のモデルマウス）にAAV-GRK2-DJ8を投与し、エピネフリン投与後の心臓でのMEKiRの発現が低下するかを検討する。å
今後はAAV-βarrestin2-DJ8も完成しているので、GRK2と同時に感染させ、GRK2とβarrestin２の双方が高発現した時にどの様になるかを検討する。
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