| 研究課題/領域番号 |
19H03683
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山上 淳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (80327618)
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| 研究分担者 |
高橋 勇人 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (40398615)
渡辺 貴志 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (50406815)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 天疱瘡 / 自己反応性B細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、天疱瘡の原因となるデスモグレイン（Dsg）に対する特異的なB細胞を患者から単離・クローニングすることにより、自己抗体の構造・自己反応性B細胞の特徴の検討を通じて天疱瘡の病態を解明し、より疾患特異的な治療法の開発につなげることである。
2019年度は、これまでの予備実験を生かして、より多くの天疱瘡患者からDsg特異的B細胞を単離することができた。単離されたB細胞のIgGの可変領域を、Fab型のモノクローナル抗体として安定発現細胞株（HEK293）に導入し、フローサイトメトリーでDsg分子との反応性を確認した。得られたモノクローナル抗体はELISAでDsgと反応し、正常ヒト皮膚を基質とした間接蛍光抗体法で表皮細胞表面に結合したため、天疱瘡を起こしている自己抗体を反映していると考えられた。
上記の結果をもとに、天疱瘡患者ごとのDsg特異的B細胞の自己抗体ライブラリーの作成を進めた。IgGがクローニングされた細胞株について、可変領域のV領域、D領域、J領域それぞれの遺伝子使用状況、体細胞超変異（somatic hypermutation）の頻度などをデータベースと照合し、天疱瘡の自己抗体に使われているVH遺伝子についての検討も進んでいる。並行して、Dsg特異的B細胞を単一細胞としてRNAシーケンスを解析したデータも増えてきている。自己反応性を確認したDsg特異的B細胞の表面マーカー、サイトカイン、転写因子などの発現解析を試みており、自己抗体の産生に関わっているB細胞では、B細胞の活性化・増殖に関わる転写因子等の発現が上昇していることが示唆された。さらに多くの症例からデータを集め、前述した自己抗体のレパトア解析と合わせることで、自己反応性B細胞の活性化機構の解明が期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記の通り、天疱瘡患者の末梢血リンパ球からDsg特異的B細胞を単一細胞として分離するとともに、単一細胞におけるRNAシーケンス解析を行う実験手法が安定した。当初の予定どおりに、患者内で天疱瘡を起こしていると推測されるDsg特異的B細胞および自己抗体に関するデータが増えてきているため、研究計画の進捗は順調と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今までの研究実績から、天疱瘡患者から単一細胞としてDsg特異的B細胞を解析する手法が確立されてきた。その症例数を拡大していきながら、さらに効率を上げて有意義なデータを発信することをめざしていく。
患者ごとの単一細胞の分離・解析法が確立されて多数の症例に拡大できれば、天疱瘡という疾患全体でのDsg特異的B細胞レパトアを樹立することが可能となる。また、データ量が増えたら、得られた配列を統計学的に解析して、可変領域の遺伝子使用状況や塩基配列からDsgとの反応性および病原性の推測を試みる。難病情報センターによると、日本国内で天疱瘡として指定されている患者は約3000名であるが、その1%にあたる30名の患者で自己抗体・自己反応性B細胞ライブラリーを確立すれば、天疱瘡の全容を推測できるデータが得られると考えている。将来的には、申請者の所属施設を中心に展開されている天疱瘡患者レジストリに登録されている情報と関連させて、検出された自己抗体・自己反応性B細胞クローンと、臨床的な病勢（活動期と寛解期との比較など）や予後因子（治療への反応性など）との関係を検討し、研究成果を患者に還元していきたい。
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