| 研究課題/領域番号 |
19H03685
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
合山 進 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (80431849)
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| 研究分担者 |
長門石 曉 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (30550248)
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70432804)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | タンパク質間相互作用 / 転写因子 / エピゲノム因子 |
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| 研究実績の概要 |
転写因子やエピゲノム制御因子は、様々な遺伝子の発現を制御することにより生体の恒常性を維持している。これまで転写・エピゲノム因子を標的とする薬剤の開発は困難とされてきたが、最近の技術革新により、タンパク質間相互作用(Protein-Protein Interaction: PPI)制御に基づく創薬が可能となってきた。そこで本研究では、最新のPPI制御技術を活用し、造血器腫瘍原因転写因子やエピゲノム因子の標的薬開発を目指している。
今年度は、コムギ無細胞タンパク合成技術を用いて、ビオチンタグ、FLAGタグを付加したRUNX1、 CBFB、EVI1、CtBP1、STUB1タンパクを合成した。これらの合成タンパクを用いて、(1) RUNX1-CBFB、(2) EVI1-CtBPの結合を検出するAlphaScreenを確立した。さらに、AlphaScreenと東京大学創薬機構の化合物ライブラリ(9600種類の化合物を含むCore library10000)を用いて、上記の分子間相互作用を阻害する化合物の探索を行い、いくつかの結合阻害化合物候補を同定した。
また、Thermal Shift Assayを用いて、RUNX1およびSTUB1にに直接結合する化合物を探索した。これらのアッセイには精製タンパクが大量に必要なので、大腸菌を用いてRUNX1のRUNTドメイン、STUB1のTPRドメインを合成した。次に、バーチャルスクリーニングを用いて結合可能性の高い化合物を選別した。そして上記精製タンパクと結合候補化合物を用いてThermal Shift Assayを行い、RUNT、TPRドメインに直接結合する化合物を同定した。
以上の２つのアプローチを用いて、転写因子標的薬の候補を複数同定することに成功した。今後これらの化合物の性質を詳細に解析し、生物学的活性を持つ薬剤の開発を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度はコムギ胚芽および大腸菌を用いた各種タンパクの合成に成功し、またこれらのタンパクを用いたAlphaScreen、Thermal Shift Assayの確立に成功した。さらに、これらのアッセイを用いた1次スクリーニングを行い、複数の候補化合物を同定した。タンパク合成や実験系の確立を予定どおり進めることができており、ここまではおおむね計画どおり順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) タンパク結合阻害剤の探索
昨年度施行したAlphaScreenによる再現実験を行い、たしかに結合阻害作用を持つ化合物を同定する。また、それらの化合物が細胞内でタンパク質間相互作用を阻害するかどうかを、細胞を用いたレポーターアッセイ、Fluoppiの系、そして増殖評価アッセイを用いて検証する。
(2) 標的分子結合化合物の探索
昨年度絞り込んだ候補化合物を用いて再度Thermal Shift Assayを行い、より低濃度でRUNX1およびSTUB1に結合する化合物を同定する。また、マイクロスケール熱泳動（MicroScale thermophoresis / MST）アッセイや等温滴定型カロリメトリー（ITC）アッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイ、Cellular Thermal Shift Assayを用いて、候補化合物が確かに標的タンパクに結合することを確認する。
(3) 細胞アッセイ系の確立
RUNX1、EVI1、ASXL1およびそれぞれの変異体をマウス骨髄細胞やヒトさい帯血CD34+細胞に導入し、これらの転写因子、エピゲノム因子の造腫瘍活性をin vitroで再現する実験系を確立する。また、これらの細胞をレシピエントマウスに移植する実験も行い、in vivoで病態を再現できるかどうかを検証する。
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