造血幹細胞制御と造血器腫瘍発症におけるUTXの酵素活性と複合体形成による機能解析

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H03693
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 本田 浩章 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (40245064)
• 研究分担者: 世良 康如 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (40836532) ; 本田 善一郎 お茶の水女子大学, 保健管理センター, 教授 (70238814)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: エピジェネティクス / ヒストン脱メチル化 / UTX、UTY / ヒストンH3K27 / COMPASS-like complex / 造血幹細胞 / 造血器腫瘍

研究実績の概要

この申請では、定常時に正常UTX（UTXWT）を発現し、誘導可能に脱メチル化活性を欠失したUTX変異体（UTXDD）またはCOMPASS-like complexとの結合部位であるTPRドメインを欠失したUTX変異体（UTXΔTPR）を発現するマウス（UTXWT/DD、UTXWT/ΔTPR）を作製し、造血幹細胞機能や造血器腫瘍発症におけるUTXの脱メチル化活性依存性、非依存性の役割を明らかにすることを研究目的とする。また、UTXのY染色体相補体UTYの機能欠失マウスも作製し、UTX/UTYファミリーによる造血系制御の全体像の解明も試みる。
これまで、UTXWT/DDとUTXWT/ΔTPRについて複数のラインが得られ、１）正常マウスとの交配による目的alleleの生殖細胞系伝達、および２）UTXWTが正常に機能しているかどうか、について、ホモマウス作製により検討した（UTXWTが機能しない場合ホモマウスは胎生致死になる）。その結果、目的alleleが予想された形でノックインされたのは、UTXWT/DDとUTXWT/ΔTPRについて各々2ラインと考えられた。
UTYノックアウトについては、ゲノム編集を用いて得られた複数のラインについて、coding frameがずれたラインについて正常マウスとの交配を行い、目的変異alleleの生殖細胞系伝達を確認すると共に、作製した抗UTY抗体を用いて造血細胞におけるUTY遺伝子産物の欠失を確認した。
この課題の解析の対象となるマウスであるUTXWT/DDマウス、UTXWT/ΔTPRマウス、UTY KOマウスが得られており、今後の研究に進む予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ゲノム編集の方法を用いて、定常状態でUTXWTを発現し誘導可能にUTXDDまたはUTXΔTPRを発現するマウスを作製する目的で、Utx遺伝子のintron 4にUTXWT cDNAをexon5とin-frame fusionしpAを付けloxPで挟んだものと、その下流に脱メチル化活性を欠失したUTXDD cDNAまたはUTXΔTPR cDNAをexon5とin-frame fusionしpAを付けたコンストラクトを作製した。このコントラストの5′側に約2kb、3′側に約2kbのアームを付けたものをreplacement double-strand DNAとして、intron 4の標的配列に対するcrRNA, tracrRNA, Cas9蛋白質と共にB6マウスの受精卵前角にマイクロインジェクションを行なった。UTXWT/DDとUTXWT/ΔTPRについて複数のラインが得られたが、これまでの解析の結果、目的の形でUTXWT/DDとUTXWT/ΔTPRがノックインされたのは、各々2ラインと考えられた。
UTYKOマウスについても、ゲノム編集の方法を用いてUtyのexon 7に対するcrRNAをtracrRNA, Cas9蛋白質と共にB6マウスの受精卵前角にマイクロインジェクションを行ない、得られたラインについて抗UTY抗体を用いて解析を行い、造血細胞におけるUTY遺伝子産物の欠失を確認した。
今年度予定していた骨髄機能解析、腫瘍感受性解析、ヒストンメチル化解析等については、動物実験施設の新校舎への移動があり全てのマウスラインについて体外受精・受精卵凍結を行い融解・移植して個体化したこと、および新型コロナにより実験が出来ない期間がありまた試薬の搬入の停滞もあり、予定よりも実験の進行が遅くなり来年度の施行を予定している。

今後の研究の推進方策

今後の方針としては、
１）まずUTXWT/DDマウスおよびUTXWT/ΔTPRマウスについてホモマウスを作製し、定常状態でUTXWTを発現していること、およびERT2Creマウスとの掛け合わせおよびtamoxifen投与を行い、誘導可能にUTXDDまたはUTXΔTPRが発現することを確認する。誘導可能にUTXDDまたはUTXΔTPRが発現していることが確認できたら、
２）骨髄および脾臓の造血幹前駆細胞解析を行い、造血幹細胞活性の変化について、競合的骨髄移植を行うことにより検討を行う。
３）造血器腫瘍発症に対する感受性変化について、白血病誘導ウイルスであるMOL4070を投与し、白血病発症率、白血病発症までの期間等について検討を行う。
４）UTXDDとUTXΔTPRによるメチル化変化を検証する目的で、造血細胞を抗メチル化H3K27抗体および抗メチル化H3K4抗体を用いた免疫染色を行い、UTXWTの結果と比較検討する。UTXの標的遺伝子が限られている場合にはglobalな解析では差が出ない可能性もあり、プロモーター・エンハンサーに特化したメチル化解析も併せて行う。またUTXDDがこの複合体に含まれるかどうかについて、UTXWTをコントロールとしてMLL3/4抗体を用いた免疫沈降により検討する。また、UTXΔTPRでUTXがCOMPASS-like complexから解離した際の複合体形成構成要素の変化および個々の構成蛋白質の挙動および安定性について、MLL3/4に対する抗体を用いた蛋白質複合体解析や構成蛋白質に対する抗体を用いた核内免疫染色により併せて検討を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Mutant ASXL1 induces age-related expansion of phenotypic hematopoietic stem cells through activation of Akt/mTOR pathway. (2021)
  • 著者名/発表者名: Fujino T, Goyama S, Sugiura Y, Inoue D, Asada S, Yamasaki S, Matsumoto A, Yamaguchi K, Isobe Y, Tsuchiya A, Shikata S, Sato N, Morinaga H, Fukuyama T, Tanaka Y, Fukushima T, Takeda R, Yamamoto K, Honda H, Nishimura E, Furukawa Y, Shibata T, Abdel-Wahab O, Suematsu M, Kitamura T.
  • 雑誌名: Nature Commun 巻: 23 ページ: 1826
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22053-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] UTX maintains functional integrity of murine hematopoietic system by globally regulating aging-associated genes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Sera Y, Nakata Y, Takeshi Ueda T, Yamasaki N, Koide S, Kobayashi H, Ikeda Ki, Kobatake K, Iwasaki M, Oda H, Wolff L, Kanai A, Nagamachi A, Inaba T, Sotomaru Y, Ichinohe T, Koizumi M, Miyakawa Y, Honda Zi, Iwama A, Suda T, Takubo K, Honda H.
  • 雑誌名: Blood 巻: 137 ページ: 908-922
  • DOI: 10.1182/blood.2019001044
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of aberrant ASNS imprinting with asparaginase sensitivity and chromosomal abnormality in childhood BCP-ALL. (2020)
  • 著者名/発表者名: Watanabe A, Miyake K, Nordlund J, Syvanen AC, van der Weyden L, Honda H, Yamazaki N, Nagamachi A, Inaba T, Ikawa T, Urayama KY, Kiyokawa N, Ohara A, Kimura S, Kubota Y, Takita J, Goto H, Sakaguchi K, Minegishi M, Iwamoto S, Shinohara T, Kagami K, Abe M, Akahane K, Goi K, Sugita K, Inukai T.
  • 雑誌名: Blood 巻: 136 ページ: 2319-2333
  • DOI: 10.1182/blood.2019004090
  • 査読あり
• [雑誌論文] HHEX promotes myeloid transformation in cooperation with mutant ASXL1. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeda R, Asada S, Park SJ, Yokoyama A, Becker H, Kanai A, Visconte V, Hershberger C, Hayashi Y, Yonezawa T, Tamura M, Fukushima T, Tanaka Y, Fukuyama T, Matsumoto A, Yamasaki S, Nakai K, Yamazaki S, Inaba T, Shibata T, Inoue D, Honda H, Goyama S, Maciejewski J, Kitamura T.
  • 雑誌名: Blood 巻: 136 ページ: 1670-1684
  • DOI: 10.1182/blood.2019004613
  • 査読あり
• [雑誌論文] Jmjd3 plays pivotal roles in the proper development of early-born retinal lineages, amacrine, horizontal, and retinal ganglion cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Iwagawa T, Honda H, Watanabe S.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci 巻: 61 ページ: 43
  • DOI: 10.1167/iovs.61.11.43
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dual Regulation of Histone Methylation by mTOR Complexes Controls Glioblastoma Tumor Cell Growth. (2020)
  • 著者名/発表者名: Harachi M, Masui K, Honda H, Muragaki Y, Kawamata T, Cavenee W, Mischel P, Shibata N.
  • 雑誌名: Mol Cancer Res 巻: 18 ページ: 1142-1152
  • DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-20-0024
  • 査読あり
• [雑誌論文] H3K27me3 demethylase UTX regulates the differentiation of a subset of bipolar cells in the mouse retina. (2020)
  • 著者名/発表者名: Umutoni D, Iwagawa T, Baba Y, Tsuhako A, Honda H, Aihara M, Watanabe S.
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 25 ページ: 402-412
  • DOI: 10.1111/gtc.12767
  • 査読あり
• [雑誌論文] Accumulation of versican facilitates wound healing: implication of its initial ADAMTS-cleavage site. (2020)
  • 著者名/発表者名: Islam S, Chuensirikulchai K, Khummuang S, Keratibumrungpong T, Kongtawelert P, Kasinrerk W, Hatano S, Nagamachi A, Honda H, Watanabe H.
  • 雑誌名: Matrix Biol 巻: 87 ページ: 77-93
  • DOI: 10.1016/j.matbio. 2019.10.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Kdm6a deficiency activates inflammatory pathways, promotes M2 macrophage polarization, and causes bladder cancer in cooperation with p53 dysfunction. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kobatake K, Ikeda Ki, Nakata Y, Yamasaki N, Ueda T, Kanai A, Sentani K, Sera Y, Hayashi T, Koizumi M, Miyakawa Y, Inaba T, Sotomaru Y, Kaminuma O, Ichinohe T, Honda Zi, Yasui W, Horie S, Black PC, Matsubara A, Honda H.
  • 雑誌名: Clin Cancer Res 巻: 26 ページ: 2065-2079
  • DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-19-2230
  • 査読あり
• [学会発表] 膀胱がん発症におけるヒストン修飾因子KDM6Aの機能解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 本田浩章
  • 学会等名: 国立がんセンター鶴岡カンファランス
  • 招待講演
• [学会発表] 2.ヒストン修飾因子UTXは老化関連遺伝子を制御することにより造血形維持に関与する (2020)
  • 著者名/発表者名: 世良康如, 本田浩章
  • 学会等名: 第1回レドックスR&D戦略研究会
  • 招待講演